中国农大，北生所发Nature Methods文章

来自中国农业大学，北京生命科学研究所，以及中科院计算技术研究所的研究人员发表了题为“Identification of cross-linked peptides from complex samples”的文章，介绍了一种从复杂样品中识别交联肽的新技术，相关成果就公布在Nature Methods这一杂志上。

　　

生物通报道：Nature出版社旗下的Nature Methods杂志是方法学领域的国际权威刊物，今年最新的影响因子是19.276，稳居方法学期刊的榜首。近期来自中国农业大学，北京生命科学研究所，以及中科院计算技术研究所的研究人员发表了题为“Identification of cross-linked peptides from complex samples”的文章，介绍了一种从复杂样品中识别交联肽的新技术，相关成果就公布在以上Nature Methods这一杂志上。

文章的通讯通讯作者分别是北京生命科学研究所董梦秋研究员，以及计算技术研究所的贺思敏研究员，第一作者是中国农业大学杨兵（Bing Yang，音译）。

蛋白化学交联配合质谱分析（mass spectrometry analysis）的CXMS方法能帮助研究人员获得关于蛋白折叠，蛋白-蛋白相互作用等方面的有用信息。理论上CXMS能通过鉴别复合物直接结合模式，定位结合界面，确定出一个大型蛋白复合物的整个结构，而且蛋白样品也无需像结晶技术中那样高度纯化。

但是这在实际上并未能达到，其中的原因有几方面，比如交联样品中的蛋白酶消化会产生包含规律单连，环状连接和相互连接的肽段混合物，其中相互连接的肽段是解析蛋白折叠和蛋白之间相互作用的最大信息承载体之一，但却由于消化过程中丰度低，而难以识别出来。

在这篇文章中，研究人员开发出了一种能用于识别这些交联肽段的方法：pLink，这种方法能结合质谱分析方法，解析交联肽的数据，准确估计出交联识别中的假阳性，并且这种方法也能与多种同源，或者异源的双功能交联分析方法兼容。

pLink是在pFind基础上开发出来的，后者是中国第一个具有自主知识产权的网络版蛋白质鉴定软件pFind (http://pfind.ict.ac.cn)，这一软件是由计算所生物信息学课题组开发出来，已用于提高应用质谱技术进行蛋白质鉴定的算法与系统性能，具体包括基于数据库搜索的蛋白质鉴定算法；质谱中同位素信息的应用；以及蛋白质修饰鉴定和定量化等。

pLink在pFind基础上，将研究对象的一个肽段变成了两个肽段，分析复杂样品中的交联肽，为了验证这一方法的有效性，研究人员也利用已知的结构进行了分析，并进一步在蛋白复合物，免疫沉淀初提物，以及整个细胞裂解物中进行了验证。

相关的研究数据表明，这是一种用于分析蛋白结构，以及蛋白-蛋白相互之间作用的有效工具。

今年年初，董梦秋实验室还与生物物理所等处的研究人员合作，提出了不依赖于蛋白数据库的肽段从头测序（de novo sequencing）。以前的从头测序效果欠佳，鲜有实际应用。为了此项研究的需要，董梦秋实验室与中科院计算所贺思敏研究组共同开发了肽段从头测序的质谱实验流程和算法，达到了与数据库搜索相当的鉴定效果（Chi H. et al., J. Proteome Res. 2010）。发表的PNAS文章中的两个蛋白As_SRP-1和As_TRY-5都是用肽段从头测序技术pNovo鉴定到的，表明pNovo足以支持生物学研究，尤其是对于新蛋白（序列未被收纳到现有数据库中）的鉴定有极大的帮助。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Identification of cross-linked peptides from complex samples

We have developed pLink, software for data analysis of cross-linked proteins coupled with mass-spectrometry analysis. pLink reliably estimates false discovery rate in cross-link identification and is compatible with multiple homo- or hetero-bifunctional cross-linkers. We validated the program with proteins of known structures, and we further tested it on protein complexes, crude immunoprecipitates and whole-cell lysates. We show that it is a robust tool for protein-structure and protein-protein–interaction studies.

作者简介：

董梦秋博士
北京生命科学研究所研究员

研究概述：

本实验室的研究主题包含生物学和质谱技术两部分，二者相辅相成，共同发展。

在生物学研究方面，我们以线虫为模式生物，试图了解衰老过程及其调控机制。在自然衰老过程中，线虫的转录组和蛋白质组将不可避免地发生一系列变化，借助高通量测序及质谱技术，我们可以对这些变化进行定量分析，并进一步探讨这些变化在长寿突变体线虫与野生型线虫之间有何不同。衰老过程在细胞器水平（如线粒体）上引起的变化也在我们的关注范围之内。对这些变化进行分析与归纳可以使我们更加深入地认识衰老过程，并为进一步研究调节衰老的机制打下坚实的基础。在衰老的调节机制的研究中，我们主要关注胰岛素信号通路。目前已经知道，从最上游的胰岛素受体直至下游的FoxO转录因子，所有胰岛素信号通路的关键组分都具有调节寿命的功能。然而，FoxO转录因子可以在转录水平调节一系列靶蛋白，哪些关键靶蛋白最终导致了寿命的延长仍不甚清楚。我们致力于找到这些关键靶蛋白并研究它们之间的关系，籍此了解胰岛素信号通路调节寿命的奥秘。同时，我们也在积极研究DAF-16（FoxO在线虫中的同源蛋白）的翻译后修饰状况。DAF-16是调节衰老的一个关键转录因子，其活性受到一系列蛋白激酶和磷酸酶（如钙调磷酸酶）的严密调控。我们试图探究来自外部环境和线虫体内的各种讯号如何影响DAF-16的翻译后修饰状况，并进一步阐明不同位点的翻译后修饰的组合如何最终调控DAF-16的转录活性。

在质谱方面，我们致力于基于质谱的蛋白质组学技术的应用与开发，以期为生物学研究提供新的思路与方法。 目前，我们实验室日常的质谱分析工作包括蛋白鉴定、定量蛋白质组学分析以及翻译后修饰分析。样品多是免疫沉淀的蛋白复合物或全细胞裂解液。此外，我们与所内其它实验室以及中科院计算所pFind研究小组合作开发质谱技术，主要包括肽序列从头测序的算法开发、基于电子转移解离（ETD）谱图的高效蛋白质鉴定技术、和通过鉴定交联肽段来研究蛋白－蛋白相互作用的方法。实验室目前共拥有三台质谱仪，包括一台装备了ETD的LTQ-Orbitrap质谱仪，一台离子阱质谱仪HCTultraPTM，以及一台三重四极杆质谱仪TSQ Discovery。