如何选择体外表达载体和纯化方法？[心得点评]

与原核或真核表达系统相比，体外蛋白表达系统无疑是个更加快捷的选择。无需转化和转染，也无需培养细胞，几个小时就能得到表达产物，大大节省了时间和精力。此外，体外表达也可以生产毒性蛋白，掺入重同位素用于NMR或MS分析，添加非天然氨基酸。细细想来，好处果然不少。

对于任一表达系统而言，最终目标无非是生产大量有功能且纯净的蛋白质。然而，正如世上没有两片相同的树叶，每个蛋白都是独特的，没有一种纯化方法能够放之四海而皆准。事实上，任何系统中蛋白纯化的成功率都很低。据蛋白质数据库PDB统计，原核基因中只有39%被成功表达和纯化，真核基因更低至29%。

由此看来，体外表达系统似乎是获得大量纯蛋白的更好选择。但体外表达载体和纯化方法有很多种，如何选择呢？选择恐惧症的人们又开始担心啦。为此，赛默飞世尔的蛋白表达专家开展了一系列研究，详细介绍了优化表达与纯化的策略。他们使用的是Thermo Scientific 1-Step High Yield IVT system产品。

1-Step IVT系统包含一系列载体，都满足了高水平表达的载体要求。这些载体包含目的基因上游的EMCV UTR、1-3个亲和纯化标签、以及3’ poly A尾巴。在选择亲和标签时，必须考虑到所使用的蛋白纯化方法，而每种标签都有其独特的优点。

这项研究的主要目的是了解具有某种标签组合的载体是否能在表达水平和纯化轻松度方面提供更好的结果。研究发现，与较小的标签相比，在N端或C端具有GST标签的载体往往大大提高了蛋白表达。此外，他们还发现，带有GST和His标签的多标签pT7CFE载体为纯化带来了更大的灵活性。

为了评估标签大小及类型对表达的影响，研究人员将一些基因克隆到C端带GST标签或HA标签的载体上，并评估表达水平。结果是，有时这个标签高，有时那个标签高，这取决于不同的蛋白。但是，当GST标签的产量高时，那可不是高一点点。这一结果表明，研究人员在着手表达新蛋白时，应首先检验GST标签是否促进蛋白表达，可别错过了这个轻松实现高表达的机会。

之后，他们还比较了N端和C端的GST标签对表达的影响。对于几乎所有检测过的蛋白，N端标签实现了更高的蛋白表达。

此外，研究人员还比较了体外表达蛋白的纯化效果。他们将8个不同基因克隆到多标签pT7CFE载体上，随后表达，并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂或钴离子IMAC树脂进行纯化。他们发现，谷胱甘肽亲和纯化获得了最高的产量和纯度。8个蛋白都利用谷胱甘肽琼脂糖成功纯化，而只有6个蛋白通过IMAC树脂成功纯化。

当然，作者也提到，蛋白纯化的成功是高度取决于蛋白的。不过，一些添加剂也有可能提高纯度或产量，如NaCl、咪唑、DTT、甘油等。作者也列出了它们的功能和使用浓度。此外，文中还有troubleshooting部分，相信也能解答您的部分问题。（生物通 薄荷）

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Choosing a vector and purification method for in vitro protein expression