单细胞转录组学的研究工具盘点[新品推荐]

当研究人员希望了解细胞在干什么时，他们会查看转录图谱。在过去的日子里，大约10年前，DNA芯片和qPCR是主要的研究工具。如今，RNA-Seq占了上风。这些方法都是基于群体的，体现了细胞的平均转录图谱。然而，研究人员逐渐意识到，这些策略并不太理想，至少在某些情况下。

在美国单细胞分析项目的网站上，有这样一段话：“同一群体中的单个细胞可能有很大不同，这些差异也许对整个群体的健康和功能产生重要影响。而探索群体水平特征的实验方法可能掩盖了这些关键的差异。”2012年，NIH宣布在单细胞分析项目上投入9000万美元，以便加快各个领域中单细胞分析的开发和应用。

近几年，研究人员已经开发出一些工具，能够将几个组学学科的规模降至单细胞水平，包括转录组学。一些方法是基于新一代DNA测序，另一些则依靠显微镜或流式细胞仪。不过，这些方法都发现，细胞群体看似均一，其实是高度异质性的。

RNA FISH

南非科技与工业研究院（CSIR）生命科学部的首席研究员Musa Mhlanga主要研究基因调控的复杂性及其与基因组结构的关联。实际上，他感兴趣的是细胞核中基因组DNA的物理排列如何影响其表达。

在最近的一项研究中，Mhlanga的团队研究了物理接触对三个NF-κB调控基因的共表达的影响，这三个基因分布在两条染色体上。之前的群体水平分析利用了染色体构象捕获（3C）及新一代测序技术，证明这三个位点在肿瘤坏死因子α的刺激下形成了“多基因复合体”，表明它们之间的相互作用是开启基因所必需的。

为了直接验证这个假设，研究团队通过TALEN基因组编辑技术，破坏了人脐静脉内皮细胞中的这些相互作用，随后逐个细胞检查，看看这些基因是否转录。他们采用的方法是RNA荧光原位杂交（FISH）1。

对于RNA FISH分析，细胞中RNA分子的每个拷贝都要标上多个荧光标记。在显微镜下，转录本显示为离散的点，通过计算它们，研究人员能够精确地定量细胞中存在多少个RNA分子。

目前至少有两种标记策略。Mhlanga在他的研究中使用了Biosearch Technologies的Stellaris RNA FISH策略，让40个或更多的寡核苷酸与每条转录本杂交，每个寡核苷酸都标有单个荧光染料，从而将每个分子的信号扩增40倍。Affymetrix的ViewRNA™ 策略则是基于分支DNA（bDNA）信号扩增。与RNA结合的探针并未标记，相反，它通过一座桥与支架相连，这个支架上有一系列放大序列和多达400个标记。Affymetrix的高级产品经理Corina Nikoloff将ViewRNA分析比喻成一棵树，从树干开始，然后插上树枝，再像圣诞树一样用标记来装饰。

RNA FISH是一种低通量的方法。研究人员通常查看少量的细胞及每个细胞中的少数转录本。在某种程度上，这是因为RNA FISH需要高倍放大，通常60倍或更多，这反过来意味着观察范围小。Biosearch Technologies公司发展总监Marc Beal表示，问题在于被研究的少数细胞是整个群体的代表，还是异类。

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为了解决这个问题，Biosearch正在现场测试一台名为StellarVision的成像系统。据Beal介绍，这台仪器利用一种称为“合成孔径光学（synthetic aperture optics）”的策略，利用光干涉图和计算机算法在20倍视场下同时成像数百个细胞，而无需100倍放大，也不用油。“您第一次能够看到所有细胞，而不是一两个，”Beal解释道。“这下您不用担心上下左右发生了什么。”

据介绍，Biosearch已经在2014年11月将原型机放在了宾夕法尼亚大学和贝勒医学院。此系统将在2015年第一季度上市，价格大约在15万至20万美元。

Affymetrix也开发出一种方法，让RNA FISH的通量更高。它的PrimeFlow™分析将ViewRNA延伸到流式细胞仪上。Affymetrix负责PrimeFlow的高级产品经理Dylan Malayter表示，这种方法让研究人员能同时测定单细胞中的蛋白质和mRNA。举个例子，假如一位研究人员想鉴别特定的细胞亚群，并定量其中的转录本。“只需要简单的设门。”

至于Mhlanga，他的研究结果表明，染色体的接触确实是转录活性所必需的。对于NF-κB调控的基因，仅仅5%的细胞内存在染色体接触，也正是这些细胞发生了转录共调控。他说：“如果我们没有在单细胞水平开展这些实验，我们可能永远没看到这一点，也无法了解这个机制。”

单细胞RNA-Seq

单细胞转录组学的另一种策略是RNA-Seq。与测定少数转录本的RNA FISH不同，RNA-Seq一次调查所有或大部分的转录本。此外，FISH需要研究人员提前了解要研究哪些转录本，而RNA-Seq是无偏向的。当然，RNA FISH能揭示转录本的亚细胞定位，但RNA-Seq不可以。“单细胞RNA-Seq是FISH的完美补充，”Fluidigm单细胞基因组学业务的主管Candia Brown谈道。

单细胞RNA-Seq的挑战在于单细胞的部分，具体而言，分离单个细胞并制备测序文库。这就是Fluidigm的C1™系统所做的工作。C1是一台微流体驱动的系统，让研究人员能捕获、裂解多达96个细胞并制备文库。据Brown介绍，他们正在开发的一种新设计能处理超过750个细胞。

Broad研究院的Aviv Regev正与Fluidigm的研究人员合作，利用C1从1,775个树突状细胞中制备测序文库。分析鉴定出极少量细胞（1,775个中的2个），它们比其他细胞更早表现出抗病毒的基因表达谱2。

对每个细胞而言，Regev的研究平均产生了450万条序列。但是，加州大学旧金山分校的Arnold Kriegstein实验室与Fluidigm的合作研究表明，如果目标仅仅是区分细胞亚群，则每个细胞产生50,000条序列就足够了3。Brown解释道：“这取决于生物学问题。如果您正在寻找肿瘤，那么可能需要再深一点 – 也许每个细胞需要100-500万条序列。”

对于那些想尝试单细胞分析的研究人员，Brown给出了这样的建议：这一领域可能看上去挺困难，但研究人员不必害怕。至少，资助机构似乎喜欢单细胞分析所带来的“新颖观点”。同时，随着技术的进步，进入的门槛也在降低，不再触不可及。

（作者：Jeffrey M. Perkel / 生物通编译）

参考文献：

[1] Fanucchi, S, et al., “Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes,” Cell, 155:606-20, 2013. [PubMed ID: 24243018]

[2] Shalek, AK, et al., “Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation,” Nature, 510:363-9, 2014. [PubMed ID: 24919153]

[3] Pollen, AA, et al., “Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex,” Nat Biotechnol, 32:1053–8, 2014. [PubMed ID: 25086649]