定点突变，你的选择有很多[选购宝典]

1993年的诺贝尔化学奖授予了两位科学家。一位是PCR之父、鼎鼎大名的Kary B. Mullis，另一位则是加拿大化学家Michael Smith。他的获奖理由是“对基于寡核苷酸的定点突变的建立做出了突出贡献”。

早期，人们尝试用辐射或化学诱变剂来实现突变，但并非位点特异的。70年代，Michael Smith与美国生物化学家Clyde Hutchison合作，利用突变的寡核苷酸引物和DNA聚合酶开发出一种更加通用的定点突变（site-directed mutagenesis）方法。之后，这种方法被不断改进，在质粒中引入单碱基变化以及插入和缺失。

如今，定点突变技术已成为研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造基因的常用手段。利用这种技术，我们能够研究蛋白质相互作用的位点，筛选有着理想性质的突变，引入或删除限制性酶切位点或标签。

基本原理

定点突变的基本过程需要合成一条短的DNA引物。这条引物包含所需突变，并与突变位点周围的模板DNA互补，这样它就能与目的基因杂交。突变可以是单碱基变化、多碱基变化、插入或缺失。单链引物由DNA聚合酶延伸，然后再由连接酶封闭缺口。之后转化大肠杆菌，产生突变的双链DNA分子。最后，通过DNA测序选择突变体，检查它们是否包含所需的突变。

最初，这种方法常面临突变效率低的问题，这主要是因为大肠杆菌存在甲基介导的碱基错配修复系统。针对这一问题，Thomas Kunkel进行了改进。他将待突变的DNA片段插入噬菌体，并转化到两种酶（dUTPase和uracil deglycosidase）缺陷的大肠杆菌中。这两种酶是DNA修复系统的一部分，防止dCTP自发脱氨形成dUTP。在突变的大肠杆菌菌株中复制噬菌体DNA，它的酶学机制就错误掺入dUTP来取代dTTP，产生包含尿嘧啶的单链DNA（ssUDNA）。随后这个ssUDNA被提取出来，作为突变的模板。所产生的异源双链DNA就由一条包含dUTP的亲本链和一条包含dTTP的突变链组成。之后，DNA被转化到携带野生型dut和ung基因的大肠杆菌菌株中。在那里，含有尿嘧啶的亲本DNA链被降解，只留下突变的DNA链。

新型工具

近年来，多家公司又对定点突变的方法进行了进一步的完善，推出了简单易用的试剂盒，如NEB、安捷伦、赛默飞世尔等。如今，你也有了更广泛的选择。

NEB

Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit是NEB最新推出的产品。大家都知道，在大肠杆菌中繁殖的质粒DNA通常是甲基化的，而体外聚合而成的质粒则不会，利用这一差异，此试剂盒使用甲基化敏感的限制性内切酶DpnI来去除野生型质粒。

它利用Q5热启动超保真DNA聚合酶以及两条背对背的引物，在2小时内引入插入、缺失和替换。整个过程简单高效。首先，利用标准引物和Q5 DNA聚合酶进行指数扩增。然后，将扩增产物加入激酶-连接酶-DpnI酶的混合物中，在室温下孵育5分钟。这些酶实现了PCR产物的迅速环化和模板DNA的去除。最后，转化大肠杆菌细胞。

据NEB介绍，这种背对背的引物设计有诸多好处，不仅能转化不带切口的质粒，还能实现指数扩增，产生更多的扩增产物。性能强劲的Q5也为你带来信心。它的保真度比普通Taq酶高100倍，使得错误率极低，突变效率通常在85%-95%。NEB专家一般建议客户挑选三个克隆去测序就够了。至于质粒的大小，NEB试过14 kb，但客户试过20 kb。

就这种方法而言，插入片段的大小仅仅受限于引物合成的技术。一般而言，每条引物的5’端最多可附加50个核苷酸，这样就能插入100个核苷酸。不过，需要提醒一下，对于60nt以上的引物，建议使用HPLC或PAGE纯化。

对于引物设计，你也不必担心，NEB提供了一个在线的引物设计软件NEBaseChanger（NEBaseChanger.neb.com）。另外，NEB的网站也给出了一些指引。替换可设计在突变引物的中间，引物3’端至少要有10 nt与你的质粒互补。对于缺失，引物要设计在待缺失区域的两侧，方向相反。对于6 nt以上的插入，插入序列可分成两半，附在两条引物的5’端。

我想了解Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit的详细信息

安捷伦（Stratagene）

说到定点突变，我们怎么能忘了QuikChange呢？这个明星产品被数以千计的文献所引用，成为许多突变实验的首选。如今，Stratagene公司已被安捷伦科技公司收购，但仍在不断提供新的产品，比如这款俗称闪电的QuikChange Lightning定点突变试剂盒。

QuikChange系列试剂盒也利用DpnI来去除甲基化的亲本质粒，不过它的引物设计策略与Q5不同，是使用两条直接互补的寡核苷酸，各自包含突变。这些引物退火和延伸后，产生了带切口的质粒，在转化大肠杆菌后修复。由此可见，突变过程分为简单的三步。首先使用热循环仪合成突变链，然后使用DpnI降解亲本DNA模板，最后通过转化步骤完成实验。

安捷伦认为，这种线性扩增策略只以亲本DNA作为模板进行扩增，能减少不必要的错误。由于循环次数少而模板的起始量较高，因此确保了以最少的错配进行稳定的线性扩增。这种非PCR的方法结合保真度超高的聚合酶，几乎可完全消除不需要的第二位点突变。

之前的QuikChange版本使用的是PfuUltra高保真DNA聚合酶，Lightning新版本则采用专利配方的QuikChange Lightning DNA聚合酶。这种融合型的聚合酶具有增强的持续合成能力，极为准确和高效，能扩增长片段的目标序列，且延伸速度更快（30秒/kb）。而新的DpnI酶将消化时间从1小时缩短到5分钟。因此，QuikChange Lightning试剂盒可以在三小时内引入点突变、插入突变或缺失突变，随后进行过夜转化。

这个试剂盒中包含了QuikSolution试剂，可促进大片段质粒的复制。因此，它适合富含GC的复杂质粒或长达14 kb的大片段质粒。此外，QuikChange系列还有多点突变试剂盒，可同时在五个不同位置上对质粒DNA进行定点突变；而QuikChange HT能产生最多含12万个重组突变体的大型突变库，适合蛋白质工程研究。

赛默飞世尔

Phusion高保真聚合酶大家也许用过，至少听说过。以这款酶为核心，赛默飞世尔也推出了Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit，可在任何类型的质粒DNA中引入点突变、插入或缺失。它的突变策略与Q5相似，都是采用背对背的引物，扩增突变的DNA。这种方法的好处是能够在引物的5’端加上一条尾巴，而插入较长的片段（100 bp左右）。Phusion Hot Start II DNA聚合酶在突变过程中发挥重要作用，以其高保真性而减少了不想要的二次突变，适用于10 kb以下的质粒。

整个操作流程与Q5相似，不过少了一个降解起始模板的步骤。该公司认为，在这种方法中，痕量的模板DNA被指数扩增，因此未突变模板所占的比例是极小的，也就没有必要在单独的步骤中破坏它。不过，需要注意的是，这个试剂盒需要磷酸化的引物，因为试剂盒中含有T4 DNA连接酶，而非激酶。

Clontech

Clontech的In-Fusion克隆系统听上去像是个做克隆的，其实它也能用于定点突变。它结合In-Fusion HD酶以及反向PCR扩增，实现了各种突变。突变中所采用的两条引物有着相反的方向，但5’端有着15 bp的重叠，并掺入了感兴趣的突变。

在实验过程中，首先是设计引物，然后利用高保真的CloneAmp HiFi DNA聚合酶开展PCR反应，得到线性的PCR产物。之后再开展In-Fision反应，利用重叠的15 bp让线性DNA重新环化，接着就是转化和筛选了。CloneAmp HiFi这种酶的性能也是杠杠的。根据Clontech的数据，它的延伸速度极快，每kb只需5秒。此外，错误率也很低，复杂模板上大约每45200个碱基有一个错配。

环化过程就是著名的In-Fusion反应。凭借In-Fusion酶独特的末端接合能力和15 bp重叠，线性DNA就能轻松环化。当然，这种克隆体系也兼容任何载体。对于普通克隆，只要载体和插入片段的末端有15个相同的碱基，克隆就能轻松完成，就是这么任性。

我对In-Fusion克隆系统感兴趣

应用

研究人员可以利用定点突变来实现多个体外应用，不过最广泛的应用还是改变表达载体上的氨基酸。另外一个应用是插入比较短的序列（最多100 bp），比如蛋白质标签，或者在当下热门的CRISPR应用中，插入向导RNA序列。这可以通过Q5或Phusion定点突变试剂盒来实现。

当然，DNA合成正变得越来越便宜，研究人员也可以选择合成突变基因，而不是改变现有的序列。不过，对于大多数实验室而言，基因合成仍然是比较贵的。随着价格的下降，这种局面可能会改变，不过就目前而言，定点突变试剂盒仍是个好选择。（生物通 余亮）