清华大学发表Nature文章

　　

2015年7月15日，清华大学颜宁研究组在《自然》（Nature）在线发表题为《葡萄糖转运蛋白识别与转运底物的分子基础》（Molecular Basis of ligand recognition and transport by glucose transporters）的长文（Article），报道了人源葡萄糖转运蛋白GLUT3处于不同构象的3个高分辨率晶体结构，并通过与之前该组解析的GLUT1的结构比对，完整揭示了葡萄糖转运蛋白底物识别与转运的分子机理，为基于结构的小分子设计提供了直接依据。生命科学联合中心博士后（医学院）邓东和一年级博士生（生命学院）孙鹏程为本文的共同第一作者，颜宁教授为本文的通讯作者。
 
葡萄糖是地球上各种生物最主要的能源物质，为生长代谢提供能量，并且作为前体参与合成其他生命组成大分子。葡萄糖分子高度亲水，无法自由通过疏水的生物膜，其进出细胞需要依靠膜上的转运蛋白完成。主要协同转运蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily, MFS）葡萄糖转运蛋白GLUTs在此过程中至关重要。人体中的GLUTs共有14种，目前研究较清楚的是GLUT1,2,3,4（简称GLUT1-4），它们负责向人体的不同组织转运葡萄糖，比如GLUT1主要负责葡萄糖进入红细胞和跨越血脑屏障，GLUT2主要在肝、脾、小肠等内脏细胞中发挥作用，GLUT3负责为神经系统摄取葡萄糖，GLUT4则是肌肉和脂肪组织的主要葡萄糖转运蛋白。此外，越来越多的研究发现GLUT1和GLUT3在多种实体瘤中超量表达。这是由于肿瘤细胞的快速增殖使其处于缺氧环境中，无氧条件下依靠糖酵解产生的ATP比有氧代谢少了10倍以上，因此肿瘤细胞需要大量表达GLUTs以满足葡萄糖的超量摄入，这就是被称为“沃伯格效应”（“Warburg effect”）的现象。这一现象使得GLUT1和GLUT3成为了潜在的肿瘤细胞标志物，具有诊断价值。临床上利用“正电子发射断层扫描”（PET）监控氟代脱氧葡萄糖（FDG）在人体组织中的分布以监控葡萄糖代谢和肿瘤成像，FDG也是通过GLUTs进入细胞。此外，前期实验显示一些GLUT1转运抑制剂在抑制小鼠肿瘤生长方面表现出较好的效果，使得GLUTs成为了潜在的肿瘤治疗靶点。因此，GLUTs的结构生物学及生物化学研究将为这一潜在应用提供重要的分子基础。
 
颜宁教授领导的研究组过去八年致力于系统揭示GLUTs的结构与工作机理。2012年，她领导的团队解析了GLUTs大肠杆菌同源蛋白XylE与底物分子木糖及抑制剂葡萄糖的复合物晶体结构，并通过同源建模首次描绘出GLUTs的大致结构，为研究GLUTs的转运机理研究提供了重要线索（http://www.nature.com/nature/journal/v490/n7420/abs/nature11524.html）。自此以后，她们聚焦于极富挑战性的人源葡萄糖转运蛋白GLUT1-4的结构生物学研究，并于2014年初解析了具有近一个世纪研究历史、备受关注的人源GLUT1的三维结构（http://www.nature.com/nature/journal/v510/n7503/full/nature13306.html），这也是第一个人源次级转运蛋白的晶体结构。
 
GLUT1的结构处于向胞内开放的状态，是GLUTs蛋白在行使转运功能过程中众多构象的一种。为了揭示整个转运过程，获得GLUTs处于其他不同转运状态下的结构信息至关重要；为了理解底物识别，则需要获得GLUTs与底物的复合物结构。针对这些问题，该研究组精心设计实验，利用膜蛋白脂立方相(Lipidic Cubic Phase, LCP) 结晶和微聚焦X-射线衍射，最终解析了人源葡萄糖转运蛋白GLUT3处于3种不同状态的高分辨率晶体结构。其中GLUT3与底物分子葡萄糖的复合物晶体结构处于朝向胞外闭合的状态，分辨率高达1.5埃，是目前为止分辨率最高的转运蛋白结构。这一超高分辨率首次清晰表明GLUT3可以识别葡萄糖α和β两种异构体。
 
为了进一步得到GLUT3蛋白向胞外开放的构象，他们推测加入竞争性抑制分子麦芽糖或者纤维二糖之后，可能将GLUT3稳定于面向胞外的构象，这一猜测获得生化实验的支持。最终他们获得了GLUT3与麦芽糖结合的向胞外开放和向胞外闭合两种状态下的晶体结构。至此，通过进一步比较GLUT1向胞内开放的结构，GLUT家族蛋白通过交替开放（alternating access）转运底物的整个过程已经基本呈现在眼前。这不但是对于GLUTs家族转运机制研究的突破性进展，也为转运蛋白领域和膜蛋白结构生物学领域的研究起到了导向作用。同时，高分辨率GLUT3与底物结合的结构也为今后的小分子抑制剂的设计提供了重要的理论基础。
 
此项研究工作得到科技部重大研究计划的资助。颜宁是清华大学拜耳讲席教授，并获得美国HHMI国际青年科学家、杰出青年基金和中组部首批青年拔尖创新人才计划的支持。

图1： 人源葡萄糖转运蛋白GLUT3处于不同状态的3个晶体结构

图2： 迄今已获得的葡萄糖转运蛋白GLUTs的晶体结构以及在此基础上进一步完善的GLUTs工作模型

原文摘要：

Molecular basis of ligand recognition and transport by glucose transporters

The major facilitator superfamily glucose transporters, exemplified by human GLUT1–4, have been central to the study of solute transport. Using lipidic cubic phase crystallization and microfocus X-ray diffraction, we determined the structure of human GLUT3 in complex with d-glucose at 1.5 Å resolution in an outward-occluded conformation. The high-resolution structure allows discrimination of both α- and β-anomers of d-glucose. Two additional structures of GLUT3 bound to the exofacial inhibitor maltose were obtained at 2.6 Å in the outward-open and 2.4 Å in the outward-occluded states. In all three structures, the ligands are predominantly coordinated by polar residues from the carboxy terminal domain. Conformational transition from outward-open to outward-occluded entails a prominent local rearrangement of the extracellular part of transmembrane segment TM7. Comparison of the outward-facing GLUT3 structures with the inward-open GLUT1 provides insights into the alternating access cycle for GLUTs, whereby the C-terminal domain provides the primary substrate-binding site and the amino-terminal domain undergoes rigid-body rotation with respect to the C-terminal domain. Our studies provide an important framework for the mechanistic and kinetic understanding of GLUTs and shed light on structure-guided ligand design.