BioTechniques：如何验证抗体的特异性？

　　

现在，生物学家都意识到基础研究的重复性存在问题。也许，一部分的责任在于抗体，这也推动了抗体的验证工作。尽管用户有责任验证抗体，但制造商同样有责任。近日，Bethyl Laboratories的Sharon Bonnette博士在《BioTechniques》上介绍了一种验证抗体的目标特异性的高通量方法。

虽说生物医学研究的重复性不是太高，但如果说低于50%，你也许不相信。不过根据6月发表在《PLOS Biology》上的一篇文章，情况确实如此。根据Amgen团队的研究，近90%公开发表的成果，如通路和癌基因，无法由Amgen的科学家重复。这不仅浪费了研究经费，也大大拖延了科学发现。

在蛋白质研究中，研究人员高度依赖于商业化的抗体。据统计，大约95%的抗体用户依赖预先制备的抗体。遗憾的是，科学家并不信赖这些抗体，而厂商的验证通常被认为是“不够，也不可靠的”。因此，他们在购买抗体时，不仅要花很多钱，也要花很多的时间来挑选。

对于制造商而言，制备抗体并不是限速步骤。主要的限制在于证明它们能识别预定的目标，并确定它们的效价。为了制备出合格的试剂，制造商在高通量的制备之后必须加上高通量的验证。

为了实现这一点，Bethyl Laboratories利用一种高效的检测来正确识别WB中的目的条带，并验证抗体特异性。这项检测包括WB和免疫沉淀（IP）分析，使用了针对同一目标蛋白的不同表位的抗体。

他们设计并合成了二到四个不同的肽段抗原，然后在兔子中制备了针对不同抗原的抗体，并进行纯化。之后，他们开展了IP和WB分析。每个抗体被用在独立的反应中，以便将阳性裂解液中内源表达的目标蛋白免疫沉淀。随后在SDS-PAGE胶上分离免疫沉淀物并转印。

在抗体孵育过程中，他们使用了表位特异性的抗体。通过远端表位抗体识别出的条带被认为是预期的目的条带。一旦目标条带被确定，这些抗体将接受进一步的检测，以评估它们在WB中的性能和特异性。这个抗体必须识别特定的目的条带，并表现出最小的交叉反应性，才算合格。

作者认为，用户和供应商都有责任验证抗体的特异性。在WB/IP的联合分析中，利用针对不同表位的多个抗体来验证特异性是一种有效的方法。（生物通 薄荷）

原文检索

A Western Blot and Immunoprecipitation Assay to Verify Antibody Specificity

BioTechniques, Vol. 59, No. 3, September 2015, pp. 168–169