CSH Protocols：如何检测原代细胞中的自噬

　　

十月将至，诺贝尔奖在近日成为热门话题，各大媒体和研究机构纷纷推出了自己的预测名单。细胞自噬也位于这份榜单之上。其实，这项技术一直是近年来的热点，文献数量呈爆炸式的增长。在这一期的《Cold Spring Harbor Protocols》上，英国的研究人员也介绍了如何检测原代哺乳动物细胞中的自噬。

细胞自噬（autophagy）是负责降解细胞质成分的溶酶体分解代谢通路。蛋白酶体通路主要负责蛋白的降解，而自噬则降解大量的细胞质材料，包括整个细胞器如线粒体、细菌或脂类。尽管细胞死亡过程中存在自噬的迹象，但自噬是否在体内执行细胞死亡，仍然是有争议的。在这篇文章中，研究人员介绍了如何利用免疫荧光、免疫组化、流式细胞仪等来检测自噬。

（图片来自原文）

自噬是个复杂的过程。在哺乳动物中，Atg8家族的8个成员被鉴定出。最为人熟知的是LC3，这是大多数经典的自噬检测分析中的关键分子。LC3的脂化导致LC3（LC3-II）在western blot中比非脂化形式（LC3-I）跑得慢，因此可以检测。当自噬水平低时，LC3-I均匀分布在细胞中，而一旦自噬发生，LC3的脂化导致其重新定位到自噬体上，这可以通过免疫荧光显微镜来观察。第三种经典方法就是利用电镜来观察双膜的囊泡。

不过，作者也提出一些注意事项。比如，在检测原代细胞混合物中一种细胞的自噬时，需要进行细胞分选。然而，磁珠或流式细胞仪的分选会诱导自噬的形成，导致难以分辨。这时可利用ImageStream成像流式细胞仪来鉴定细胞类型，并同时测定自噬，从而避免分选。

以上的这些操作都需要添加溶酶体抑制剂，以实现自噬体的积累或检测。作者例举了bafilomycin A和chloroquine，它们可抑制自噬体和溶酶体的融合。E64d和pepstatin抑制剂可抑制溶酶体的蛋白酶。对于自噬的诱导，他们使用1-2小时饥饿或雷帕霉素等药物。不过，作者也提醒，许多化合物并不是仅仅针对自噬通路的。

作者也介绍了一些方法来检测自噬调控的后果。p62作为衔接蛋白，可与LC3结合，从而靶向自噬体并促进泛素化蛋白的清除。当自噬潮受阻时，p62积累。通过p62的免疫组化可评估组织切片中的自噬水平。不过，p62 mRNA的增加也有可能导致p62蛋白的积累，应当同时测定。

自噬水平的下降往往伴随着线粒体自噬的减少，导致受损线粒体和活性氧簇（ROS）积累。这些可通过荧光探针来检测。作者介绍了一种操作，利用同一种探针通过流式细胞仪来同时定量线粒体损伤或ROS，以及表面标志物。

最后，作者还提到了原代细胞和细胞系的差异。他们指出，与细胞系相比，原代细胞有着高的基础自噬水平，在饥饿诱导时增长幅度小。每种细胞类型需要不同的刺激物来诱导自噬。此外，不同细胞的自噬水平也存在差异，即使是B细胞和T细胞。由于饥饿、锻炼等多种刺激可诱导自噬，因此组织捐献的时间也需要考虑。（生物通 薄荷）

原文检索

Techniques for the Detection of Autophagy in Primary Mammalian Cells

doi:10.1101/pdb.top070391 Cold Spring Harb Protoc 2015.