NIR近红外荧光western blot——高效检测磷酸化蛋白

NIR近红外荧光western blot检测方法使用不同荧光基团标记的二抗，即可同时检测磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，实现了更快速地磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白检测，同时实现了更准确蛋白定量。

        在进行蛋白质磷酸化研究时，要求检测磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，但由于两者分子量差距非常小，如果使用传统的化学发光方法，需要先使用磷酸化蛋白抗体进行孵育，然后进行剥离后，重孵育非磷酸化蛋白抗体，对定量产生潜在的消极影响（例如剥离过程中可能损失一部分原始蛋白或者剥离不够完全，与无剥离步骤的印迹膜定量相比，定量准确性和重复性必然降低），而且剥离和重孵育步骤将耗费更多的试剂和时间。

        NIR近红外荧光western blot检测方法使用不同荧光基团标记的二抗，即可同时检测磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，实现了更快速地磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白检测（见流程图1），同时实现了更准确蛋白定量（见图2b）。

 
图1：化学发光和NIR荧光Western blot流程时间对比表

        从图1可以看出化学发光检测约需6.5hour，而荧光方法同时检测磷酸化蛋白和非磷酸蛋白，时间≤3hour（见图1），关键就在于NIR近红外荧光western blot实现了双重抗体同时孵育，节省了化学发光剥离和重孵育膜所需要的时间。实验结果如下图2a（化学发光）和2b（NIR近红外荧光）所示。

STAT1蛋白和STAT1磷酸化蛋白化学发光western blot：印迹膜首先使用rabbit-anti-phospho-STAT1进行孵育和成像。之后进行剥离，使用mouse-anti-STAT1重孵育.使用AzureC600 chemi功能成像
泳道：marker  1）10ug 未经处理的的Hela细胞裂解液  2)10ug IFNa-处理的Hela细胞裂解液
                        3）20ug 未经处理的的Hela细胞裂解液  4) 20ug IFNa-处理的Hela细胞裂解液

图2a

STAT1蛋白和STAT1磷酸化蛋白近红外荧光westernblot：分别使用mouse-anti-STAT1和rabbit-anti-phospho-STAT1一抗孵育结合，之后分别使用IR-800（绿色）和IR-700（红色）标记的二抗进行孵育，使用AzureC600多功能分子成像系统的NIR700和NIR800通道进行采集。            

图2b

        从上述实验比较及结果中可以看出，NIR近红外荧光多重Western blot是检测共迁移条带（磷酸化蛋白）检测最理想的实验方法。

        那么在进行western blot实验时该如何选择合适的检测方法呢？请参考图3的方法选择。 

图3：选择化学发光还是荧光western blot？

        化学发光——是最为常用的western blot检测方法。化学发光法灵敏，适用于检测单一蛋白或低丰度蛋白、目的蛋白是否表达、蛋白纯度分析等实验研究。

        荧光方法——适用于定量分析的蛋白实验和同一样品中不同蛋白的多重定量检测，翻译后修饰蛋白检测尤其是共迁移条带（磷酸化蛋白的检测）。

        NIR近红外荧光检测方法，因其印迹膜自发荧光更低，灵敏度更高，信噪比更好，是首选的荧光检测方法。

        所以根据您的实验应用不同需求，选择合适的实验方法。

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