染色体上大片段DNA的直接克隆及移植

　　

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生物通报道：Red重组广泛应用于基因敲除、基因突变和基因置换. 利用依赖同源序列的Red重组技术可以在细胞内直接克隆目的DNA到克隆载体上，但应用Red重组体内直接克隆染色体上大于10 kb的DNA序列非常困难.近期来自军事医学科学院生物工程研究所，安徽大学健康科学研究院等处的研究人员利用一种抗性拆分-融合策略成功地从供体菌染色体上直接克隆了约50 kb的DNA序列, 并将其移植到受体菌的染色体上.

根据目的DNA来源是环状DNA还是线性DNA, 可以将重组克隆方法分为两类: 线性加环状同源重组法(linear plus circular homologous recombination, LCHR)和线性加线性同源重组法(linear plus linear homologous recombination, LLHR). 利用LCHR方法可以轻
松地从BAC(Bacterial artificial chromosome)质粒上直接克隆约30 kb的目的DNA片段, 或从染色体上直接克隆3 kb的目的DNA片段. 由于染色体上DNA序列极其复杂, 当直接克隆的序列长度超过10 kb时, 几乎难以获得正确的阳性克隆.

为此，研究人员采用了一种抗性互补策略(见图). 该策略将线性质粒载体上的抗性标记cat基因分为两部分: cma(含135 bp与cmb同源的同源臂)和cmb. 它们每一部分单独都没有抗性, 仅当融合在一起时才会恢复抗性. 首先, 将cmb和完整的kan抗性标记基因(作为这一步的筛选标记)一起定向整合到染色体上拟克隆区域的一侧.

然后, 将一端含有cma 的线性质粒载体通过电转方式导入细胞内, 该线性质粒载体另一端含有与染色体上拟克隆区域另一侧同源的50 bp序列. 拟克隆区域一侧的cmb与线性质粒载体的cma通过Red同源重组融合形成完整的cat基因, 借助CmR抗性筛选大大提高了筛选效率. 应用该策略成功克隆了大肠杆菌DH1-Z染色体上长度为48.2 kb的Z单元(该区域中4 个非必需区已被无痕删除). 然后将重组质粒导入受体菌DH36细胞内, 利用双链断裂促进同源重组技术使Z单元定向置换受体菌染色体上与Z单元部分同源的对应区域, 获得了基因组上4个非必需区同时被删除的删减菌DH40. 本方法可用于基因组组装及基因组功能研究.

这一方法可以用于微生物天然产物生物合成途径的异源表达、基因组组装和大片段DNA的功能研究. 将未经基因组测序的基因簇直接克隆至表达载体或整合至异源基因组进行异源表达, 从而得知该基因簇的功能.

在此基础上, 通过同源重组对基因簇调节区域进行改造, 提高天然前体量进而提高天然产物表达量. 传统的从头合成组装方法不利于合成几十甚至上百kb的混合来源的生物合成途径, 而直接克隆的方法不仅能获得目的基因簇, 将多个大片段拼接成超大基因簇家族, 还能对其进行定点突变、插入、无痕敲除等基因改造, 合成天然产物的衍生物. 对于实验室难以培养微生物, 可以直接克隆已知天然产物的相应合成路径异源表达, 产量高且安全有效, 节约生产成本; 该方法也可用于发现潜在的未知的大基因簇, 发现有价值的天然产物; 也可在异源表达天然产物的同时, 通过同源重组改造合成路径, 合成新颖的天然产物衍生物.

（生物通）

原文检索：

朱莹, 杨艳, 邓平平, 等. 染色体上大片段DNA的直接克隆及移植. 中国科学: 生命科学, 2016, 46: 183–191
Zhu Y, Yang Y, Den P P, et al. Direct cloning and tranplanting of large DNA fragments from Escherichia colichromosome. Sci Sin Vitae, 2016, 46: 183–191, doi: 10.1360/N052015-00182