拷贝数变异（CNV）分析的工具变迁[新品推荐]

在经典遗传学中，我们了解到人类通常携带基因的两个拷贝 – 一个来自母亲，另一个来自父亲。不过，数量也可能不是二，这就被称为拷贝数变异（CNV）。在DNA复制的过程中，基因可能丢失或重复，从而改变其数量。基因拷贝数的增加或减少往往影响其编码的蛋白质。事实上，CNV可用于生物学和医学中多个领域的研究。

据Pacific Biosciences的首席科学官Jonas Korlach介绍，CNV与人类进化、性状和疾病相关联。“比如，与猿猴相比，人类的AQP7基因拷贝数增加，这与出汗调节体温的能力增加存在关联，也许有利于人类祖先狩猎时长距离的奔跑。”他补充道。

拷贝数的变化也与一些疾病相关，包括自闭症、癌症和心脏病。“一些较小重复的拷贝数差异与许多神经退行性疾病相关，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）或Lou Gehrig疾病，”Korlach谈道。

高科技工具

过去，人们利用细胞遗传学技术研究CNV，特别是荧光原位杂交（FISH）。赛默飞世尔的营销副总裁Kim Caple表示：“FISH是视觉的，也是主观的。”尽管价格不贵，但是FISH只能鉴定数千个碱基或更大的拷贝数变异。

为了提高特异性，一些研究人员使用芯片技术，如比较基因组杂交芯片（aCGH）。芯片技术“有专门的数据分析软件，缩短了获得结果的时间，”Caple说。“除了CNV，芯片也提供单核苷酸多态性（SNP）的数据。”芯片方法可针对特定基因或整个基因组。此外，它的分辨率优于FISH。芯片的分辨率达25 kb，而FISH为40-100 kb。

在一项肾细胞癌的研究中，南卡罗莱纳医科大学的Cynthia A. Schandl及其同事利用SNP芯片来研究CNV。她表示，这项技术不仅能计算整个基因组内的拷贝数，还能确定嵌合以及杂合性丢失的区域。想象一下，一个人携带了正常和异常版本的抑癌基因。若不幸丢失了正常的那个，就无法抑制癌症生长，这就是杂合性丢失（LOH）的例子。事实上，LOH在许多癌症的发展中起作用，而CNV分析可研究这种致癌机制。

为了更深入了解染色体的结构，研究人员也采用DNA测序来分析CNV。这些测序技术“经常用于科研，也正在向临床发展，”Korlach说。“一些测序分析能够以单碱基对的精度鉴定拷贝数变异。”

测序方法带来了明显的优势。麻省理工学院的博士研究生Kristin Knouse认为，主要好处在于在全基因组范围内高分辨率地评估拷贝数变异，而不像FISH只研究几个预设定的位点。此外，在开展双端测序时，人们有望确定一些推定CNV的信息，如杂合性丢失和结构重排。当然，天下没有免费的午餐。Knouse认为测序的主要缺点在于费用。

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没那么简单

尽管分析CNV的技术在不断进步，“但准确解释拷贝数变异仍然很困难，”Korlach谈道。“第一个挑战在于鉴定变异时不够精确。”也就是说，FISH、aCGH，甚至一些DNA测序技术，都不能划定拷贝数增加或减少的精确边界。“此外，这些分析不能说明基因组中是否插入了新的拷贝，”Korlach解释道。

尽管测序带来了更多深度数据的好处，但它的缺点在于“非均匀的全基因组扩增有可能带来人为的拷贝数改变，”Knouse说。“因此，关键要采用严格的质量控制标准，来限制假阳性的可能。”

此外，这些技术本身也很复杂。在被问及分析拷贝数变异的主要挑战时，Caple指出，分析需要专业知识，也相当耗时。她特别指出了将整个过程自动化以及处理意义不明的变异的挑战。

豪华工具箱

为了更多地了解CNV，科学家们需要更加精确的数据，而现代化工具也开始崭露头角。“新的DNA测序技术有望将拷贝数变异的边界和位置精确定位到单个碱基，这是最高的分辨率，”Korlach指出。然而，并非所有测序都能达到这种能力。

“短读长测序仪分析100-200 bp的DNA片段，不能清晰地分辨许多拷贝数变异，因为许多变异的长度是读长的10-100倍，”Korlach解释道。“长读长测序仪，如PacBio RS II和Sequel平台，产生了长达50 kb的序列。”简单来说，测序仪的读长越长，分析变异就越轻松。

Korlach还指出，长读长测序仪能确定基因组中究竟有多少个拷贝，以及这些拷贝位于什么位置。“即使是那些很小的三核苷酸重复，它们通常超出了短读长测序仪的范围，比如与脆性X综合征相关的FMR1基因中的CGG重复。”

未来在何方

长读长测序仪的成本下降正在扩大测序的应用，这将带来更大的数据集。“这将让人们更好地理解‘正常的’拷贝数变异，并最终全面区分致病变异和正常变异，”Korlach说。

不断增长的数据也在驱动人们以更多的方式去分析结果。例如，Caple提到了Affymetrix的ChAS 3.1，这是一个数据分析软件包，适合CNV的细胞遗传分析。她还提到，患者的数据共享将减少意义不明的变异。

最终，CNV研究界的数据共享将从这些结果中挖掘出更多的信息，这些知识有助于加强基础研究和转化研究。

（作者：Mike May / 生物通编译）