如何利用CRISPR对表观基因组进行修饰[创新技巧]

【字体: 时间:2017年02月22日 来源:生物通

编辑推荐:

  在表观遗传学中,DNA或组蛋白的共价修饰与基因的表达或沉默有关。为了改变DNA修饰,研究人员过去曾使用组蛋白去乙酰酶等工具,但无法实现靶向的表观遗传修饰。随着基因组改造的浪潮来袭,人们开始使用锌指核酸酶和TALEN来实现表观遗传修饰。如今,新工具CRISPR的出现,让靶向修饰变得更容易。

在表观遗传学中,DNA或组蛋白的共价修饰与基因的表达或沉默有关。为了改变DNA修饰,研究人员过去曾使用组蛋白去乙酰酶等工具,但无法实现靶向的表观遗传修饰。随着基因组改造的浪潮来袭,人们开始使用锌指核酸酶和TALEN来实现表观遗传修饰。如今,新工具CRISPR的出现,让靶向修饰变得更容易。

激活

P300乙酰转移酶

Charles Gersbach的实验室将催化功能区失活的Cas9(dCas9)与p300乙酰转移酶的催化结构域融合,增加了启动子和增强子区域的H3K27ac组蛋白修饰。如今,他们已构建出pcDNA-dCas9-p300 Core和pcDNA3.3-Nm-dCas9-p300 Core表达载体。

Tet1脱甲基酶

Ronggui Hu的实验室构建出pdCas9-Tet1-CD,能够对哺乳动物细胞进行靶向胞嘧啶脱甲基化。这个质粒可与pcDNA3.1-MS2-Tet1-CD一起使用,来减少甲基化,并激活转录。Rudolf Jaenisch的实验室则提供这种修饰的慢病毒版本Fuw-dCas9-Tet1CD。

抑制

DNA甲基转移酶3A

Vlatka Zoldoš的实验室构建出pdCas9-DNMT3A-EGFP和pdCas9-DNMT3A-PuroR,可在哺乳动物细胞中实现靶向的胞嘧啶甲基化。共表达的标志物EGFP和PuroR实现了转导细胞的选择和分选。Grant Challen的实验室也构建出组成型(pCMV-dCas9-D3A)和Tet依赖型(TetO-dCas9-D3A)的载体。对于慢病毒表达,Rudolf Jaenisch实验室同样提供Fuw-dCas9-Dnmt3a和Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP。

为什么使用表观遗传修饰?

若希望改变基因表达,表观遗传修饰肯定不是唯一的一种CRISPR技术。将dCas9与转录激活因子VP64融合能激活转录,而dCas9与KRAB融合能抑制转录。这两种方法也招募表观遗传机制,那么,使用直接的表观遗传修饰物有优势吗?

当然,使用什么工具,取决于您想要什么样的结果。如果您想要研究一种特定修饰的效果,那么表观遗传工具将是最好的选择。

此外,CRISPR工具的另一个潜在优势是它们的持久性和遗传性。由靶向修饰所留下的表观遗传标记也许能更频繁地被子细胞遗传。Stolzenburg等人曾比较了ZFN-KRAB 和ZFN-DNMT3A,发现KRAB诱导的沉默是短暂的,可快速逆转。然而,DNMT3A诱导的甲基化却能持续存在100天。

在某些情况下,表观遗传修饰的效果比激活剂/阻遏物效果更好。Hilton等人发现,dCas9-p300的转录激活效果优于dCas9-VP64,特别是在靶定远端的增强子时。这些工具的效果可能依赖于细胞类型和背景,因此在设计实验时尝试多种CRISPR工具,也是不错的想法。(生物通 余亮)

P.S. 本文中提到的各种质粒可在Addgene网站上找到。

延伸阅读

CRISPR华裔牛人不止张锋 这位学者连发Nature子刊等文章改进CRISPR

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号