CAR-T疗效关键点：CAR-T细胞杀伤活力评估方法——升级篇

对于CAR-T开发者来说，除了选择合适的肿瘤抗原很重要以外，如何增强CAR-T细胞的增殖活性和杀伤活性也是多年来CAR-T的一个研究重点。这期我们就来回顾一下提高CAR T活性的研究都有哪些。

CAR-T 的发展历史主要是围绕增强活性为主。CAR-T 1.0到CAR-T 3.0的变体现在了CAR的胞内信号区。从只用CD3ζ信号链上的酪氨酸序列作为“信号1”来激活T细胞，到。信号1虽然可以激活CAR-T细胞并使其靶向地清除目标细胞，可惜无法促进细胞的持续增殖和促进IL-2的分泌，导致T细胞在体内很快就凋亡，其持久性成为**代CAR-T细胞在临床应用上的一大障碍。为了提高活性，第二代CAR-T细胞在信号1的基础上加上了一个共刺激信号CD28或CD137，作为“信号2”。信号2不仅促进T细胞的分裂，IL-2的合成与表达和抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌，还能够使其抵消肿瘤细胞微环境带来的不利影响，但不影响其抗原特异性。不同研究都表明搭载了信号2的CAR-T细胞与**代相比，展现出了更优越的显疗效和持续性。而第三代的CAR-T，则是在信号1和信号2的基础上再加上一个共刺激信号分子，使其活性获得了进一步提高。只是现在暂时还没有第二代CAR-T和第三代CAR-T活性比较的报导文献。

 图1：CAR结构发展过程

除了在胞内信号区增加共刺激信号分子来提高细胞活性以外，研究者也利用其他方法来巧妙地改造CAR，使改造后的 T细胞能在体内发挥*大的治疗效果。

与肿瘤细胞的斗争中，CAR-T的免疫攻击常常由于肿瘤产生的免疫抑制信号而削弱。这些信号包括抑制性细胞因子IL-4，IL-10和肿瘤生长因子 Beta（TGF-beta）等，这些因子可由肿瘤微环境中的细胞或基质组分产生。Molecular Therapy的一篇报道中，研究人员在靶向前列腺干细胞抗原（PSCA，一种在前列腺癌细胞中高表达，但是在正常细胞中不表达的蛋白）的CAR-T细胞上进一步改造，将 IL-4 受体胞外段与 IL-7 受体胞内段结合使这些 CAR-T 细胞产生了一种新的反转细胞因子受体（ICR），研究表明，在一种产生 IL-4 的胰腺癌细胞模型，这些表达 ICR 的 T 细胞在 IL-4 的刺激下增殖能力反而升高了。

 图2 [1]：研究者在CAR-PSCA的基础上添加了反转细胞因子受体（ICR），使改造后的T细胞在 IL-4 刺激下的增殖能力不减反增。

Nature Reviews上面的一篇综述就总结了一些能提高CAR-T效果的方法。

 图3 [2]：改善CAR-T治疗效果的方法总结。 a. 武装CAR-T细胞：T细胞不仅表达CAR，还会分泌IL-2来抵抗肿瘤微环境的抑制。b. 双受体CAR: 双受体CAR-T包含了识别肿瘤细胞抗原的CAR和把肿瘤细胞分泌的细胞因子转化成活化信号的CAR. c. 自然杀伤细胞（Natural killer cells, NK细胞）受体CAR: 把NK细胞的受体，如NKG2-D，整合到抗原识别域，可增强CAR-T细胞对正常细胞和肿瘤细胞的分辨能力。d. 阻断免疫检查点：来自于肿瘤微环境的免疫检查点信号PD-1或者CTLA‑4会对T细胞活性造成抑制作用。通过利用这两者的受体抗体就可以阻断其配体-受体的结合，削弱对T细胞的抑制。 e. 改善T细胞持久性：由于机体会对CAR衍生的外源多肽产生免疫反应，*终导致改造的免疫细胞的破坏。通过向胰腺癌病人回输两种不同靶向的CAR T细胞（一种识别CD19，一种识别mesothelin），其中CD19-CAR用来清楚B细胞，从而阻止破坏mesothelin-CAR抗体的产生，*终改善CAR T细胞持久性。f. 靶向肿瘤血管细胞：血管生成素，如VEGF，会导致肿瘤的恶化与迁移。一些肿瘤基质细胞或者肿瘤细胞会大量表达VEGFR-2。一些临床前的研究表明，靶向VEGFR-2的CAR T可有效去除肿瘤基质细胞，但不会对正常细胞有影响。

可以看出，CAR-T细胞的增殖活性和杀伤活性是评价其治疗效果的一个重要因素，相信在接下来一段时间里面，如何提高这两方面活性也是CAR-T研究工作者们的一个重要研究主题。把研究进行到体内水平之前需要有好的体外水平数据支撑，那通常评价CAR-T细胞的活性和杀伤力的方法都有哪些呢？

免疫细胞 (Effector) 对肿瘤细胞 (Target) 杀伤活性评价

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程都涉及到免疫细胞 (Effector) 和肿瘤细胞 (Target) 两种细胞存在，因此不能采取传统的细胞增殖活性检测手段 (如 MTT、ATP 等方法) 直接进行检测。需要采用不同的标记手段。目前采用的评价方法，包括以下这几种。

1. 放射性同位素 ⁵¹Cr 释放检测

同位素 ⁵¹Cr 释放是*经典的也是*精确的评价免疫细胞对肿瘤细胞杀伤的细胞毒性检测方法。⁵¹Cr可特异性标记 Target 肿瘤细胞，洗涤并离心去除多余⁵¹Cr 后，加入 Effector 免疫细胞共同培养，Effector 免疫细胞启动杀伤程序后，将 Target 肿瘤细胞裂解，⁵¹Cr随之释放到上清中，使用 Gamma 计数仪或液闪计数仪检测释放到上清中的⁵¹Cr含量评价杀伤活性。

 图4：放射性同位素 ⁵¹Cr 释放检测原理示意图

2.  BATDA DELIFA 时间分辨荧光检测

BATDA 的检测原理与同位素 ⁵¹Cr 释放的方法相似，通过特异性乙酰酯化的荧光探针 BATDA 标记 Target 肿瘤细胞，酯化的 BATDA 可穿透细胞膜随后被活细胞内的乙酰酯酶去乙酰化，去乙酰化的 TDA 不能再次透过细胞膜而滞留的细胞内。

图5：BATDA 检测原理图

BATDA 方法与 ⁵¹Cr 释放方法操作步骤一致，洗涤离心去除多余染料，加入 Effector  免疫细胞，裂解后的 Target 肿瘤细胞将 TDA 释放到上清中，与时间分辨荧光探针 Eu 结合形成 Eu-TDA 复合物，*终通过检测该复合物的时间分辨荧光信号评价免疫细胞杀伤活性。

与 ⁵¹Cr 释放方法相比，BATDA 检测方法在保证标记特异性的基础上，具有更高的检测灵敏度，且从可操作性、安全性及数据稳定性等方面也更有优势。BATDA DELFIA 检测方法已被广泛应用于细胞杀伤活性评价，目前已有近千篇学术论文采用该检测方法。

3. Luciferase Based Killing Assay 生物发光检测

除了以上的各种放射性及非放射性光吸收及荧光染料标记的方法以外，萤火虫荧光素酶报告基因系统 (Luciferase Based reporter Gene System) 特异性标记 Target 肿瘤细胞，不仅可用于体外免疫细胞杀伤评价，还可以直接用于活体动物水平的肿瘤免疫模型评价。Luciferase 报告基因系统是以萤光素 (luciferin) 为底物来检测萤火虫萤光素酶 (fireflyluciferase) 活性的一种报告系统。在构建报告基因表达质粒时，将萤火虫萤光素酶的序列插入在管家基因的启动子后面，当细胞正常增殖和表达时，萤火虫萤光素酶同步表达，其表达量以及活性代表了细胞的增殖活性。

荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化的过程中，会产生生物发光（bioluminescence）。其光信号的多少即可代表 Target 肿瘤细胞的量，在进行 ADCC 检测时，Effect 免疫细胞不具有此表达系统，在检测时不参与发光，因此检测到的光信号即可排除免疫细胞的干扰，只反映肿瘤细胞的增殖活性。构建好 Luciferase 稳转肿瘤细胞株以后，即可采用该方法对免疫细胞杀伤活性进行快速评价。该方法简单、快速、特异性好，目前越来越多的科研人员开始使用该方法对免疫细胞特性杀伤进行体内-体外活性评价。

 图6：Luciferase Based Killing Assay检测原理图

评价CAR T细胞增殖活性

1. 免疫细胞代谢活性 (ATP 含量) 化学发光检测

ATP（三磷酸腺苷）是细胞活性的标志物，其仅存在于具有代谢活性的细胞内。由于萤光素酶和其底物 D-luciferin 反应需要ATP的存在才能产生光信号，其产生的化学发光信号同 ATP 含量成正比，因此可以通过检测发光强度反映细胞的代谢活性。PerkinElmer的ATPLite试剂盒是基于这个反应来达到高灵敏地检测细胞活性（*低 5 个细胞/孔），线性范围可达 5 个数量级，操作步骤简单，且信号稳定。无论是从灵敏度还是实验操作，都优于传统的MTT/XTT方法。

 图7：生物发光反应

 图8：ATPlite 1 step实验操作流程

2. 免疫细胞增殖 （DNA 复制能力）时间分辨荧光检测

BrdU 是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的 DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞内新合成的 DNA 中（细胞周期 S 期）。这种掺入可以稳定存在，并可随着 DNA 复制进入子细胞中。使用镧系元素 Eu 标记的 BrdU 特异性抗体可检测 BrdU 的掺入，从而判断细胞的增殖能力。Eu 标记的 BrdU 特异性抗体检测法与传统的同位素（³H-Thymidine）标记掺入法相比，在具有更好的检测灵敏度及信噪比的同时，操作便捷性及安全性更高。

 图9：细胞增殖检测原理图

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参考文献：
[1] Mohammed, Somala, et al. "Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer." Molecular Therapy 25.1 (2017): 249-258.
[2] Jackson, Hollie J., Sarwish Rafiq, and Renier J. Brentjens. "Driving CAR T-cells forward." Nature reviews Clinical oncology 13.6 (2016): 370.