四种miRNA建库方案大比拼[心得点评]

近年来，组织和体液中的microRNA（miRNA）已经成为一类新兴的生物标志物，有望用于疾病的诊断或监控。尤其是液体活检样本如血液或尿液等，可以通过微创或无创过程反复取样，样本容易获取，故对此类样本进行miRNA生物标志物检测是特别理想的。

循环miRNA这种理想中的生物标志物要想在实践中得到广泛应用还要看有没有灵敏、准确且经济的miRNA分析技术。新一代测序（NGS）技术有望担起这个重任，因为它具有单核苷酸分辨率，可同时分析多个样本，并且能够发现新的miRNA。然而，small RNA测序的文库制备还存在着不少挑战，比如接头连接的偏倚、接头二聚体的形成，以及如何适应起始量极低的样本，而后者对于液体活检尤为关键。

为此，英国和以色列的研究人员近日评估了市场上的四种small RNA测序试剂盒，并将实验结果发表在《RNA Biology》杂志上。研究者认为，这项工作有助于人们根据自身的条件和需求来选择合适的建库方案。

在这项研究中，研究团队评估了Bioo Scientific的Nextflex Small RNA-Seq Kit v3、Takara/Clontech的SMARTer smRNA-Seq Kit、NEB的NEBNext Small RNA Library Prep Set，以及QIAGEN的QIAseq miRNA Library Kit。这些试剂盒都能够处理起始量有限的样本（1-100 ng），均适用于Illumina测序仪。

利用这些试剂盒，研究人员制备了人类血浆、人类血清、小鼠大脑组织以及miRXplore通用参照的文库。他们主要从三个方面来评估文库制备方法：1) miRNA定量的灵敏度和准确性；2) 富集miRNA的能力；3) 流程的便利性和自动化的潜力。

 
图1. small RNA测序文库制备示意图，以及各种文库制备方法的比较。

图1概括了small RNA测序（sRNA-seq）文库制备的流程。除了SMARTer smRNA-Seq kit是采用无需连接的tailing方法，其他试剂盒都采用连接方法将3’和5’接头与miRNA连接。不过，在QIAseq操作中，RT阶段引入了一段特异性的分子条形码（UMI，橙色虚线）,从原理上可以实现低起始量样本更准确的定量分析。黄色三角形表示这几个步骤容易引入偏倚。

文库制备过程是否引入偏倚？

为了评估建库过程中miRNA计数是否失真，研究人员此次使用了miRXplore通用参照，它包含950多个等摩尔比的合成miRNA。他们利用相同的分析管道对四种试剂盒进行平行分析。结果显示，对于参照中的539个人类miRNA，平均而言有470个miRNA被检测到。这些试剂盒鉴定出的miRNA数量相当，具体而言SMARTer检测到501个，QIAseq 487个，Nextflex 466个以及NEBNext 424个。这些结果显示了建库方法是否真实反映了起始材料的多样性。

由于参照中的每种合成miRNA都以等摩尔存在，故所有检测到的miRNA在测序时都应该有相同的计数。于是，研究人员接着计算了四种试剂盒的变异系数（CV）。他们发现，Nextflex、SMARTer和QIAseq的CV都在1.4左右，表明性能相当。相比之下，NEBNext文库却有着更高的CV（~2.7），显然来说对于结果会有很大的影响。通过一系列实验，研究人员认为SMARTer和QIAseq在定量合成参照样本的miRNA时提供了最准确和最灵敏的结果。

文章还提到，PCR过程中的克隆扩增也是潜在的偏倚来源。为此，QIAseq试剂盒在RT阶段引入了独特的分子条形码，可以很好地解决这个问题。通过对于测序结果中分子条形码种类而非绝对的reads数量进行统计，它避免了扩增过程中引入的偏倚对定量准确性所产生的影响，还原了样本的真实表达信息。如果需要多个PCR循环来应对极低的样本或RNA起始量时，QIAseq这种技术会特别有用。

富集miRNA的表现如何？

接下来，研究人员又利用四种试剂盒，对健康志愿者的血浆和血清样本进行文库制备。众所周知，血浆和血清富含不同类型的小分子ncRNA。因此，为了在分析大量样本的同时维持测序深度，建库方法应富集miRNA，而不是其他的小分子ncRNA和mRNA降解产物。

他们将测序reads映射到各种小分子ncRNA，包括miRNA、tRNA、rRNA、piRNA等。各种试剂盒在映射到miRNA的reads比例上有不同表现，比如QIAseq（血浆约58%、血清35%），Nextflex（血浆约41%、血清约33%），NEBNext（血浆约11%、血清10%）以及SMARTer（血浆3%、血清1%）。这些数据表明QIAseq能够最好地富集miRNA，特别是针对血浆样本（图2）。

 
图2. 人类血浆和血清样本中small RNA文库的组成。

之后，研究人员试图研究血浆和血清文库中的miRNA组成。以往的研究报道了miRNA在体液和组织样本中的不对称分布，即少数miRNA占了大多数的reads。此次实验的结果与以往的结论一致，对于血浆样本，十种最常检测到的miRNA在所有映射到miRNA的reads中占64%，而血清样本更是占到70%（所有试剂盒的平均值）。对于QIAseq制备出的文库，这个百分比低于平均值（血浆55.0%、血清63.8%），表明miRNA计数的偏态分布略低，结果最佳。

同样地，研究人员还评估了这些试剂盒在组织样本上的表现。他们利用四种试剂盒来制备小鼠大脑组织的文库，发现除了SMARTer之外，文库包含的大多是映射到miRNA的reads。各个试剂盒的比例分别是：QIAseq 85%（最佳），NEBNext 84%，Nextflex 64%和SMARTer 17%。总的来说，组织文库中的miRNA分布也是不均匀的，十种丰度最高的miRNA在所有映射到miRNA的reads中占了65%。

总体而言，结合人类血浆、血清以及小鼠大脑组织的数据，研究人员认为QIAseq和NEBNext试剂盒在富集miRNA上的表现最佳，而QIAseq和Nextflex能够对血液和大脑组织样本开展高效的miRNA组分析，综合来看QIAseq能对于不同类型样本均实现最优结果的共同选择。

流程的便利性和自动化的潜力？

此外，如果将sRNA-seq用于大量样本的分析，那么就需要快速且自动化的方案。他们对比后表示，在DNA片段长度筛选之前，SMARTer有着最快的流程，不过在片段筛选步骤要花明显更多的时间和精力，而QIAseq和Nextflex都能在自动化平台上完成整个流程，因为片段筛选是仅通过磁珠分离进行的，不再需要非常繁琐复杂的切胶回收过程。

作者结语

研究人员总结道，无论是体液还是组织，QIAseq在富集miRNA的reads上始终有着良好的表现，特别是对于血清血浆样本中hY RNA可进行有效的抑制以及表现出较低的定量偏倚，能够自动化完成高通量的miRNA文库制备。在如接头二聚体污染、miRNA reads比例以及工作流程便捷性等其他指标方面的评比上，QIAseq无疑也都占据了较为明显的优势，可以作为后续方案选择的重点考虑对象。

当然，作者也强调尽管建库方法有各种改进，但miRNA定量偏倚仍然存在。鉴于大多数miRNA生物标志物研究的重点是发现差异表达的miRNA，如果对照和疾病样本是平行处理的，则定量偏倚本身并不会显著影响表达变化的检测能力。不过，严重的偏倚会减少低丰度miRNA的reads，影响可靠检测其丰度变化的能力。在这种情况下，作者建议开展更深度的测序、选择偏倚较低或在文库构建过程中引物特殊设置如分子条形码的文库制备试剂盒。（生物通 余亮）

原文检索

Anna M.L. Coenen-Stass, Iddo Magen, Tony Brooks, Iddo Z. Ben-Dov, Linda Greensmith, Eran Hornstein & Pietro Fratta (2018) Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing, RNA Biology, 15:8, 1133-1145