探索组织背景下的基因表达：空间转录组学方法回顾

单细胞转录组学的出现大大拓宽了我们的视野，让我们能够深入了解细胞的多样性和状态。然而，固定的细胞和组织必须通过机械分离或酶解消化，才能实现单细胞分析，而此过程不可避免会导致原始位置信息的丢失。因此，人们无法绘制组织结构的细胞图，以及相对于其他细胞的位置。

作为生物体的基本组成单位，细胞当然并不是孤零零地飘在空中，空间位置是决定其性质的关键因素。于是，人们试图剖析不同组织的空间分辨基因表达模式，以便深入了解疾病背后的分子机制。这也就催生了空间转录组学（spatial transcriptomics）的出现。

近年来，研究人员已经成功开发出多种技术，它们能够以特定空间背景的细胞为对象，以成像法或测序法分析大量的RNA转录物。这些技术不仅提供了基因表达的数据，也有望为空间分辨基因组学、蛋白质组学奠定基础。下面我们就来介绍一些主要的技术。

smFISH及其衍生方法

一直以来，原位杂交（ISH）都是定位核酸靶点的王牌工具。它利用标记的核酸探针来确定组织和细胞中DNA和RNA的空间位置和丰度。之后不断进化，形成了单分子RNA荧光原位杂交技术（smFISH）。

与传统的方法不同，smFISH利用多条短的寡核苷酸探针（大约20 bp）来靶向同一mRNA转录本的不同区域。每条寡核苷酸仅与一个荧光团偶联，因此本身的信号微弱。不过，多条寡核苷酸与同一转录本结合，就产生了可见的荧光点，并且提高了特异性。通过荧光点的计数，可以对不同的发育阶段或不同的组织样本进行比较。

然而，smFISH方法的局限性在于荧光图像的信噪比有限，需要使用高数值孔径的物镜和高放大倍数（通常为100倍），这限制了成像的面积。为此，加州理工学院的蔡龙（Long Cai）教授开发出SeqFISH技术。

SeqFISH技术的过程如下：在第一轮杂交过程中，荧光标记的探针与每个转录本杂交成像，然后通过DNase I处理来剥离。下一轮的杂交过程采用相同的探针序列，但探针与不同的荧光团偶联。通过几次的杂交和剥离来多次检测单个转录本。与smFISH相比，它引入了信号放大步骤，因此信噪比提高了20倍。不过，这种方法需要大量的FISH探针，而且连续的杂交过程很耗时。

之后，哈佛大学著名华裔科学家庄小威又开发出一种名为MERFISH的技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。

体内转录组分析（TIVA）

TIVA是一种在空间背景下全面分析单细胞转录组的方法。它通过细胞穿透肽，将一个光激活的生物素标签引入活细胞中。标签包括一段poly(U)序列和两个通过linker连接的poly(A)片段。通过对选定的区域或单细胞进行光激活，poly(U)序列暴露出来，并与细胞mRNA的poly-A尾退火。

之后利用链霉亲和素与标签上的生物素相结合，可以收集捕获的mRNA，进一步用于RNA-seq。由此可见，TIVA方法不适用于大量细胞的分析，而且TIVA标签只能穿透活细胞，因此它在临床样本上的用途有限。不过，第二代TIVA标签已能够穿透更深的组织。

激光捕获显微切割

激光捕获显微切割（LCM）已成为一种相当成熟的方法。通过显微镜下的直接观察和激光切割，这种技术能够分离出特定位置的少量细胞或小块组织，适用于活细胞培养物、新鲜冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。通过调整激光光斑的大小，它甚至可以分离出单细胞。

这种细胞分离方法的主要优点在于提供了解离区域的原始空间信息。因此，LCM如今已与许多下游应用结合在一起，包括芯片和RNA测序。最初LCM转录组学的限制在于无法从少量细胞中获得足够的mRNA。不过，随着新一代测序技术的飞速发展，LCM转录组学也升级到单细胞水平，称为‘地形’单细胞测序（TSCS）。这项技术为了解乳腺导管内原位癌如何发展为浸润性导管癌提出了新见解。

靶向原位测序

靶向原位测序（ISS）方法可在单细胞分辨率下生成固定细胞或组织的多重表达谱。它首先将mRNA原位逆转录成cDNA，再通过锁式探针（padlock probe）开展靶点识别和滚环扩增（RCA）。由于滚环产物（RCP）是拴在模板上的，这提供了可靠定位，并通过连续的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。

研究人员已经成功运用该技术检测了乳腺癌组织切片中39个转录本的表达，以及检测前列腺癌组织中的融合转录本。由于锁式探针的高度特异性连接和环化，这种方法可区分SNP，包括致癌点突变，这一点已经在肺癌、结肠癌和前列腺癌组织样本中得以证明。ISS的主要优点在于特异性高，能够以单核苷酸分辨率识别靶点，且荧光图像的高信噪比可实现宽视野成像（20倍放大），从而降低了实验成本，并提高了成像通量。

荧光原位测序

荧光原位测序（FISSEQ）其实是ISS的一个分支，可实现无偏倚的转录组测序。它的不同之处在于利用随机六聚体在固定细胞中逆转录RNA，然后通过cDNA的环化以非靶向方式生成测序文库。之后的过程类似，通过RCA扩增环化的cDNA，并对产生的RCP进行原位测序。在去除rRNA之后，每个细胞大约可获得10-20个mRNA分子。

不过，这种方法的局限性在于测序深度低，即使最初去除了rRNA，但rRNA读数仍占总读数的80%以上。优化rRNA去除步骤有望提高测序深度。同时，RCP的大小又会限制每个细胞的读数，从而限制了该方法的灵敏度。

各种方法的比较

SeqFISH或MERFISH等靶向方法在分析的细胞数量上受到限制，因为成像需要高倍放大，但它们的检测效率高达84%。ISS可以对大量细胞进行多重分析，但即使在理想条件下，转录本检测效率仍然在5-30%。与靶向检测相比，LCM和基于条形码的空间转录组学可作为无偏倚的探索性方法，以研究特定区域内基因表达模式的总体差异。FISSEQ可看成是靶向方法和无偏方法之间的折中方案，但它的效率很低。克服分析物的数量限制以及提高检测效率将是未来几年空间分辨转录组学的主要挑战。

表1. 各种方法的比较

一旦克服了这些技术上的挑战，空间分辨转录组学将对生物学和医学产生重大影响。人们可通过比较各种组织的分子组成，将测序数据与生物学状态联系起来。这有助于我们了解细胞多样性，以及肿瘤或神经系统中的复杂相互作用。我们相信，空间分辨转录组学很快会成为一个成熟的领域，大大推进我们对多细胞生物的了解。（生物通 薄荷）