实验攻略丨CRISPR-Cas9基因编辑RNP体系实验操作及T7E1酶切效率筛选

【字体：大中小】 时间：2019年12月30日 来源：锐博生物

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　　锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白复合物）由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成，化学合成crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞，可快速实现靶基因的编辑。

基于Cas9 mRNA的全RNA体系和基于Cas9蛋白的RNP体系。由于无需繁琐的克隆构建，不再需要载体和慢病毒，准备工作少，低毒性，高效率，周期短，对哺乳动物细胞编辑效率高，脱靶低，无DNA组分，可实现一次多个crRNA指导下多靶点编辑，受到了越来越多客户的青睐！而如果您希望编辑干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，则RNP体系是比较理想的选择。

什么是CRISPR-Cas9的RNP体系？

锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白复合物）由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成，化学合成crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞，可快速实现靶基因的编辑。与传统Cas9/gRNA质粒转染相比，基因编辑效率更高，脱靶效应更低，且无DNA整合的风险，是更加理想的基因编辑系统。

一、体系的运输保存

1. 低温运输

riboEDIT tracrRNA、riboEDIT crRNA、riboEDIT Cas9 Protein、riboEDIT T7EI Enzyme（液态储存）、riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set（阳性对照为冻干粉形式，上下游引物为液态存储）等组分为干冰运输。

2. 保存方式

-20℃低温冻存，避免反复冻融，长期请置于-80℃保存，实验过程置于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

二、 riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP操作方法

1. 实验准备（以转染24孔板为例）

(1) 将riboEDIT™ tracrRNA（5nmol）和riboEDIT™ crRNA（5nmol）分别加入250μL RNase-free H2O，稀释至20μM，作为储存溶液。使用前，用RNase-free H2O进一步稀释至5μM，置于冰上备用。注：riboEDIT™ tracrRNA和riboEDIT™ crRNA可根据具体实验体系稀释至合适的浓度使用。
(2) riboEDIT™ Cas9 Protein (20μM)用Opti-MEM™减血清培养基或PBS稀释至6μM，置于冰上备用。

2. 实验步骤

（1）准备细胞：转染前18-24h，取对数生长期细胞接种于24孔板中，实验前细胞密度达到50%~70%为宜。
（2）取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEM™减血清培养基，然后加入1μL riboEDIT™ Cas9 Protein（6μM）。
（3）在以上EP管中再加入1.2μL tracrRNA（5μM）和1.2μL crRNA（5μM），crRNA和tracrRNA按1:1加入。
注：推荐crRNA：tracrRNA：Cas9 Protein使用比例1：1：1~5：5：1，最佳比例可按照表2自行优化。
（4）室温孵育10min，形成Cas9 RNP复合物。
（5）用25μL Opti-MEM™减血清培养基稀释3μL Lipofectamine 3000转染试剂。
（6）将Cas9 RNP复合物加入到转染试剂中，室温孵育15min。
（7）孵育结束后，将上述制备好的转染复合物加入到细胞培养基中，继续培养48~72h。
（8）提取基因组，使用riboEDIT™ T7EI Enzyme进行基因编辑效率检测。

表1. riboEDIT Cas9 RNP转染体系

* 转染体系需确保转染总量(pmol)，pmol/μM=加入的体积
* 请保证crRNA和tracrRNA按1:1加入

riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP的优势

从上面的操作步骤来看，相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒，riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的RNP体系的优势非常明显。主要总结如下：

（1）riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的RNP体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言，Cas9蛋白为瞬时表达，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。
（2）即用型体系，通过一步转染，5-6个工作日即可完成编辑效率检测，操作简便，显著缩短实验周期。
（3）RNP体系在转染12-24h后快速发生基因编辑，质粒载体一般需要72h。
（4）不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。
（5）在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。
（6）在大部分细胞中，可以通过转染多条crRNA对细胞中的多个靶点进行编辑，无需构建多靶点CRISPR表达载体，不引入多余的表达元件或因此导致的细胞毒性。

T7E1酶切检测靶位点编辑效率

1. 操作说明

在细胞转染后，建议使用T7E1酶切法筛选编辑效率高的crRNA进行下游实验。

2. 实验步骤

（1）提取基因组：细胞转染后48-72h后，收集细胞抽提基因组，并用微量紫外分光光度计定量。

（2）PCR扩增靶基因片段：将纯化得到的基因组DNA稀释至合适的浓度范围，吸取100ng-500ng基因组DNA用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，阳性对照组使用riboEDIT™ Positive Control crRNA Validation Set的引物进行扩增，引物信息见表2。

注：基因组DNA模板用量及PCR条件需根据反应体系自行优化。

表2. riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set 引物序列

（3）DNA片段退火：DNA片段按照表4退火体系进行混合，充分混匀后置于PCR中运行退火程序（表4）。或95℃加热5min，然后自然冷却至室温。

表3. 退火体系

表4. DNA双链退火程序

（4）T7EI酶切：退火完成后，每管加入0.5μL riboEDIT™ T7EI Enzyme（10U/μL），37℃温育30min。