捕获人BCR转录本完整V(D)J 可变区：SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit

众所周知，B细胞是适应性免疫应答的重要组成部分，其表面表达B细胞受体（BCR），可以识别病原体中的特定分子模式。

了解BCRs图谱（也就是由特定H,K,L基因片段构成的受体和克隆型多样性）不仅有助于深入了解健康个体中的适应性免疫应答，也有助于了解多种疾病的适应性免疫应答。准确鉴定免疫系统表达的克隆型和同种型有助于全面了解B细胞群体。

Takara Bio新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术，提供了一种灵敏、准确、优化的BCR库分析方法。通过5’RACE方法减少了变异性，并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。该试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合，可以捕获BCR完整V(D)J可变区，提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。

下面就详细了解一下它的特点吧！

▪ 起始样品量：从外周血单核细胞（PBMC）纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA
▪ 通过添加UMI，校正来自PCR错误、重复序列以及序列错误的读取
▪ cDNA文库构建经过优化，可以灵敏、特异地检测克隆型
▪ 可准确扩增并通过测序鉴别人IgG亚类
▪ 经过优化的PCR pooling策略，可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
▪ 灵活的pooling策略适用于不同的实验需求，以比对、识别原始链序列
▪ 可以使用Takara Bio Immune Profiler Software进行序列数据分析的完整工作流程

图1. SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程。

Panel A 第一链cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV衍生的SMARTScribe反转录酶会在mRNA模板5’末端添加几个非模板核苷酸。SMART UMI Oligos与这几个非模板核苷酸互补结合作为模板，通过RT在第一链cDNA末端添加额外核苷酸序列（也就是模板转换步骤）。然后第一链cDNA经过两轮基因特异性的PCR扩增（详见Panel B）。第二轮的巢式PCR扩增可以确保绝大多数的reads比对到B细胞受体的转录本上。

Panel B. 第一轮PCR以第一链cDNA为模板，引物包括与Illumina Read Primer 2序列互补的正向引物（PCR1 Universal Forward primer），以及与BCR重链或轻链恒定区互补的反向引物（PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）。 以Read Primer 2序列和恒定区起始，第一轮PCR特异性扩增了BCR重链或轻链cDNA的完整可变区及部分恒定区。 第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，采用半巢式引物（PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）扩增BCR重链或轻链的cDNA的完整可变区及部分恒定区。

图2. 从1-100 ng B细胞RNA中鉴定出的克隆型信号

从1 ng，10 ng和100 ng人CD19 + B细胞总RNA中，利用本试剂盒制备BCR分析IgG，IgM，IgK和IgL文库。 为了进行分析，对于1 ng，10 ng和100 ng的RNA起始，分别将文库down-sampling至100,000个，400,000个和5,000,000个reads，然后利用Takara Bio Immune Profiler Software处理。

图3. 散点图展示了用1μgPBMC RNA生成的文库之间的一致性

以来自健康供体的1μg PBMC RNA起始，一式两份制备IgG，IgM，IgK和IgL文库。 通过down-sampling至1300万次读取来分析该文库。该图包括来自技术重复的所有四个文库（IgG，IgM，IgK和IgL）。

图4. 来自不同供体的PBMC RNA的克隆型计数

对来自8个供体的10 ng PBMC RNA（不同颜色代表不同供体），分别使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit来鉴别IgG，IgM，IgK和IgL的克隆型。文库归一化为100,000 reads以进行分析。

图5. 10 ng PBMC RNA文库的测序饱和度评估

以来自单个供体的10 ng PBMC RNA起始，使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Kit制备BCR分析文库。 Panel A. 显示了不同测序深度的IgG克隆型计数，其中蓝线和紫线分别是指经过UMI修正误差和没有经过UMI修正误差的数据。IgG和其他链（IgM，IgK和IgL未在图中展示）按每个文库150万个读数进行测序，然后通过down-sampling至1,000K，500K，200K，100K，50K，10K和5K reads。 使用Takara Bio Immune Profiler Software分析不同测序深度的结果。Panel B维恩图显示了低测序深度（100K）和高测序深度（1,500K）的文库之间重叠的克隆型。

产品名称	包装量	Code NO.
SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit	12次	634466
	48次	634467

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