CRISPR文库这么多，如何选择才好？[心得点评]

确认基因型和表型之间的关系是功能基因组学的最终目标。如今，功能基因组学有了一种强大的新工具，那就是CRISPR-Cas9文库。这种方法利用慢病毒载体大规模导入全基因组sgRNA文库，能够同时靶向数千个基因，实现高通量的功能基因筛选。

大家最常用的Cas9靶定5’-NGG PAM位点，这种位点在人类基因组中平均每8 bp就出现一次，因此我们有大量的sgRNA可供选择。不过，如何选择？这才是关键。并非所有sgRNA的效果都相同，每个sgRNA的效率和特异性存在差异。这意味着设计最佳的sgRNA文库并非易事。

幸好，市场上出现了一些设计好的文库，能够拯救水深火热中的你。这些文库避免了耗时的设计和验证工作，且精心挑选的sgRNA有着最佳效率和生物学意义。不过，在选择这样的预设计文库时，你还有一些因素需要考虑。

CRISPR-Cas9工具箱

在开展CRISPR-Cas9筛选时，首先需要选择的是遗传扰动的类型，这主要取决于你想解决的生物学问题。最常见的选择是CRISPR-KO敲除文库，其中Cas9蛋白在DNA上引入双链断裂，通过基于非同源末端连接（NHEJ）的DNA修复来引入移码突变，从而破坏基因功能。这些文库的sgRNA针对组成型表达的外显子，并且通常靶向5’末端。

然而，基因敲除并非适用于所有场景。对许多疾病而言，正是基因表达的调控及相关的表型变化驱动了疾病的发展。因此，上调或下调基因可能更合适，而不是完全敲除基因，特别是在研究非编码区和必需基因，或观察不同表达水平下的表型变化时。

CRISPRi（CRISPR干扰）文库将催化失活的Cas9（dCas9）与转录抑制因子相连接，干扰转录过程，导致基因knockdown。同时，CRISPRa（CRISPR激活）文库将dCas9与转录激活因子（比如VP64或SunTAG）相连接，从而增强基因表达。选择CRISPRa文库意味着你不需要克隆和过表达感兴趣的cDNA，即可实现全基因组范围的功能获得筛选。

每个基因需要多少个sgRNA？

CRISPR文库须针对每个基因设计多个向导RNA，以确保每个目标都得到修饰，且结果具有统计学意义。每个基因的sgRNA数量越多（大约8-10个），可确保统计可靠性更高，有利于在初级筛选中鉴定表型较弱的基因。当然，这也意味着筛选工作量更大，成本更高。

减少每个基因的sgRNA数量（大约3-4个）将降低统计显著性，但会产生较小的文库，从而允许用较少的细胞进行筛选。这也意味着细胞培养的时间和成本比较低。这样的文库适用于数量有限的细胞（如原代细胞），可用于筛选多个模型且合并后开展测序，从而降低测序成本。

尽管早期的CRISPR筛选及相关的文库都是全基因组范围的，比如张锋团队构建的GeCKO文库，但之后也涌现出形形色色的文库，可关注特定的基因家族或生物学通路。例如，赛默飞世尔科技就提供了针对可成药基因组、激酶、GPCR、转录因子等目标的19种文库。

缩小筛选的范围，减少目标的数量，这种操作有不少好处。首先，可增加每个基因的sgRNA数量，以提高统计置信度，并降低测序成本和后续分析的负担。其次，还有望降低系统中的噪声，检测到可能被屏蔽的目标。

Tips：

▪ 一些CRISPR文库在使用前需要扩增，但必须确保文库扩增后的代表性
▪ 借助新一代测序可验证文库完整性，以及扩增后所有sgRNA都存在
▪ 一些文库是以立即可筛选的慢病毒形式提供的

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CRISPR文库的形式

市场上销售的CRISPR-Cas文库是针对一般用途而设计的，而目标的选择是基于基因组数据。由于基因组注释在动态变化，文库中的目标也在不断更新。因此，尽管文库是针对相同物种的，但不同文库的筛选效果可能不同。在使用过程中，你可能需要某些优化。你可以先开展全基因组范围的筛选，然后利用自定义文库开展小规模的研究。

CRISPR文库可以单质粒的形式提供，也可以双质粒的形式提供，区别就在于Cas9的导入方式。在双载体系统中，表达Cas9的质粒先导入，而sgRNA文库后导入。如果Cas9采用了可诱导的启动子，那么在sgRNA文库导入后，细胞可快速表达高水平的Cas9，从而更快实现基因敲除。

原先，由于构建好的重组载体比较大，人们只能将Cas9和sgRNA放在不同的质粒上分别导入，以确保病毒滴度高。不过，如今也出现了单载体系统。好处就是可以少做一次转染，节省时间和经费。

CRISPR-Cas9基因编辑系统的出现，为探索基因型与表型之间的关系提供了一种经济而高效的方法。目前有这么多种预设计的文库，可以帮助科学家跳过令人头疼的设计工作，享用sgRNA设计算法的最新成果。不过，具体如何选择，还是要好好斟酌一番。

（作者：Lucy Thorne博士 / 生物通编译）