16S扩增子测序中重复三次PCR是否必要？[心得点评]

传统观点认为，16S rRNA基因测序分析时需要重复三次PCR扩增，然后合并测序产物进行分析，以此避免累积效应和嵌合体形成。不过，现代的扩增子数据分析工具似乎对这种假象不太敏感。

于是，三个独立实验室的研究人员从不同环境采集了近400个样本，比较了单次PCR反应和三次PCR反应对16S rRNA测序的影响。他们发现，单次PCR反应的实验方案对结果并没有显著影响。这些结果发表在《BioTechniques》杂志上。

加利福尼亚大学圣地亚哥分校的Rob Knight评论道：“我们想了解重复三次PCR是否真的有必要，或者说它只是几代研究生流传下来的神话。”

几十年来，人们通常重复三次PCR反应，合并后开展16S rRNA基因测序，从而避免PCR的累积效应。PCR的随机性意味着某些分子更早扩增，而后续的指数扩增又明显改变了不同分子的频率。这种现象在环境DNA测序中尤为重要。

然而，这种实验方案出现以后，DNA聚合酶的合成能力和保真度都已经有了实质性的改进。因此，人们质疑重复三次PCR反应是否仍有必要，或者说单次PCR反应是否就已经足够。

于是，研究人员收集了各种类型的样本，并比较了单次和三次PCR反应对16S扩增子测序的影响。有趣的是，单次PCR反应产生的reads比三次PCR反应明显更多，且dropout更少。

由于不同环境中的结论可能会掩盖特定样品的关系，故研究人员单独采用农业样品来测试，以判断结果是否成立。他们发现，单次PCR反应产生的reads同样比三次PCR反应更多，且dropout频率相似。

研究人员还指出，建筑环境的微生物学在近年来颇受人们关注，但对分子分析提出了挑战。这些样本往往被高水平的人类DNA污染，且细菌生物量低。他们从四种常用的建筑材料中收集了96个样本并开展分析。同样地，单次PCR反应的产量高于三次PCR反应。

这些结果表明，利用现代的方法，合并三次PCR反应的产物进行16S rRNA测序相对单次PCR而言并没有优势，并且成本更高。不过，他们也指出，尽管这些结果适用于此处测试的许多条件，但在改变实验方案之前还是应该开展测试工作。

“这一结果将大大简化扩增子测序的流程，而我们认为新的实验方案将被广泛采用，”Knight总结道。（生物通 薄荷）

原文检索

Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary