暨大吴宝剑团队解析昼夜节律与药物解毒之间的关系

如今，越来越多的证据表明，药物解毒是在生物钟的控制下进行的。生物钟似乎是通过调节药物代谢酶和外排转运蛋白的表达来调节药物解毒。不过，CLOCK等时钟蛋白是否调节药物解毒以及如何调节，目前还不大清楚。

为此，暨南大学药学院的吴宝剑教授团队评估了CLOCK蛋白在药物代谢和解毒中的作用。他们发现，CLOCK蛋白通过细胞色素P450家族来调节代谢和药物解毒。该研究首次建立了Clock基因与CYP代谢之间的分子联系，并有助于时间治疗的实施，也就是根据时间药理学的知识来提高疗效和减少不良反应。

这篇题为“Role of the CLOCK protein in liver detoxification”的文章于2020年1月发表在《British Journal of Pharmacology》杂志上。

Clock基因是最早被发现和鉴定的生物钟基因。它编码BHLH/PAS转录因子家族的成员，在节律时钟的组织中起着核心作用。Clock基因突变的小鼠会出现心律失常，其昼夜节律基因表达的模式也会受到破坏。此外，CLOCK还参与了许多生理过程的调节，如细胞周期、脂质代谢、葡萄糖代谢和免疫应答。

细胞色素P450酶系（CYPs）负责了绝大多数药物的体内代谢。CYPs代谢通常将药物分子转化成生物学上无活性的代谢物。但是在某些情况下，CYPs代谢产物是有毒的。目前已经鉴定出人类和小鼠的许多直系同源CYP基因，比如人CYP2B6 vs 小鼠Cyp2b10，人CYP2A6 vs小鼠Cyp2a5等。CYP酶在肝脏中高度表达，这支持肝脏作为药物解毒的主要器官，特别是在静脉注射药物时。

Clock敲除破坏了CYP表达的昼夜节律

为了阐明CLOCK蛋白对肝脏解毒的作用，研究人员此次委托赛业生物建立了多个基因敲除小鼠品系，包括Clock敲除（Clock-/-）小鼠品系。该小鼠模型是利用CRISPR/Cas9技术删除第9-13个外显子而构建的。

qPCR分析表明，小鼠肝脏中的许多解毒基因都受到CLOCK的调控，如Cyp2a4、Cyp2a5、Cyp2b10、Cyp3a11和Cyp3a25等。值得注意的是，Cyp2a4和Cyp2a5是Clock缺陷小鼠中下调幅度最大的两个基因，而Cyp2b10是上调幅度最大的基因。此外，Clock删除使得小鼠肝脏中Cyp2a4、Cyp2a5和Cyp2b10 mRNA及蛋白的昼夜节律被破坏。这些数据都表明，CLOCK蛋白在CYP酶（特别是CYP2A4/5和CYP2B10）的调控中起到关键作用。

CLOCK调控Cyp2a4/5和Cyp2b10的表达

之后，研究人员利用Hepa‐1c1c7小鼠肝癌细胞和AML‐12小鼠正常肝细胞评估了CLOCK对Cyp2a4/5表达的调控作用。Clock的过表达导致这两种细胞中Cyp2a4/5的表达明显增加，而Clock的敲低导致Cyp2a4/5的表达下降，支持CLOCK对Cyp2a4/5的正调控。通过荧光素酶报告基因检测、EMSA实验和ChIP分析，他们发现CLOCK通过与启动子区域中的E-box元件直接结合而激活Cyp2a4/5的转录（图1）。

图1. CLOCK通过与E-box直接结合而激活Cyp2a4/5的转录。

同样地，他们利用这两种细胞评估了CLOCK对Cyp2b10表达的调控作用。实验结果表明，Clock过表达导致Hepa‐1c1c7和AML‐12细胞中Cyp2b10表达的降低，而Clock敲低导致Cyp2b10表达的增加。之前的研究提出REV‐ERBα是Cyp2b10的转录阻遏物，而Rev‐erbα/β是CLOCK的直接靶基因。因此，他们又研究了REV‐ERBα/β在CLOCK对Cyp2b10的调控中发挥的作用。与预期的一致，多个实验证实了CLOCK对Rev‐erbα/β的正调控作用。

研究人员还通过细胞和遗传实验证实了REV‐ERBα/β对Cyp2b10的负调控。接下来，通过荧光素酶报告基因检测、EMSA实验和ChIP分析，他们证实了REV-ERBα/β与Cyp2b10的启动子区域直接结合。综上来看，CLOCK通过REV-ERBα/β而抑制Cyp2b10的转录（图2）。

图2. CLOCK通过REV-ERBα/β来调节Cyp2b10。

Clock缺失让小鼠对香豆素和环磷酰胺的毒性敏感

之后，研究人员以香豆素（coumarin）和环磷酰胺（cyclophosphamide）为例，研究了CLOCK蛋白如何参与肝脏解毒。

在小鼠中，香豆素可通过CYP2A4/5解毒为7-羟基化代谢物。他们发现，香豆素处理会诱导野生型小鼠的肝毒性，且毒性具有昼夜节律性。不过，在Clock-/-小鼠中，毒性的时间差异不再存在。同时，Clock-/-小鼠的香豆素毒性水平升高，这是因为CYP2A4/5的表达下调了。总之，Clock缺失通过下调CYP2A4/5介导的代谢而加剧香豆素的毒性，并削弱其昼夜节律（图3）。

图3. Clock缺失削弱了香豆素毒性的昼夜节律。

环磷酰胺被广泛用于各种癌症的治疗。它是一种药物前体，在小鼠中被CYP2B10生物激活为4‐OH‐CPA。环磷酰胺处理可在野生型小鼠中引起肝毒性，且肝毒性严重程度取决于给药时间。不过，在Clock-/-小鼠中，环磷酰胺肝毒性的时间依赖性消失了。由于CYP2B10表达上调，毒性代谢物4‐OH‐CPA的形成增加，导致小鼠的环磷酰胺毒性水平较高。这些结果表明，Clock缺失通过上调CYP2B10代谢使小鼠对环磷酰胺的毒性敏感，并调节其昼夜节律（图4）。

图4. Clock缺失加重了环磷酰胺的毒性并调节其昼夜节律。

结论

作者表明，CLOCK蛋白是一系列CYP酶以及香豆素和环磷酰胺解毒的关键调节因子。机理研究表明，CLOCK通过直接与启动子上的E-box结合而激活CYP2A4/5，并通过REV‐ERBα/β来抑制CYP2B10的表达。这些结果将有助于在临床上实施时间治疗。（生物通 余亮）

原文检索

Zhao M, Zhao H, Deng J, Guo L, Wu B. Role of the CLOCK protein in liver detoxification. Br J Pharmacol. 2019 Dec;176(24):4639-4652. doi: 10.1111/bph.14828. Epub 2019 Dec 28.