病原微生物样本制备中的新方法&新突破

Covaris 自动聚焦声学技术作用于微量珍贵以及难处理的医学样本，可有效提高核酸得率。

检测高致病性病原微生物样本时存在前处理困难，步骤多、时间长、重复性与可扩展性差、需要高温灭活等问题，所以在临床实验室难以实现标准化。今天小编将推荐一种更好的样本制备方法，邀请大家跟小编一起来关注其在病原微生物检测及鉴定上带来的新突破。

高性能样本处理方法

Covaris 自动聚焦声学（Adaptive Focused Acoustics，AFA）技术是在传统超声波处理基础上的技术革新，聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的样本处理结果，避免传统超声能量过剩可能引起的样本处理过度及热损伤。

AFA技术在DNA剪切中的准确稳定的表现使其在NGS领域备受推崇。其实该技术在微量珍贵以及难处理的医学样本制备中也有不俗的表现，可有效提高生物大分子得率，获得足够且高质量的核酸样本用于下游分析。这是现有条件下提高检测灵敏度的有效手段，可减低可疑或者假阴性结果。

有数据表明：对于珍贵/微量及难处理的样本，基于Covaris AFA聚焦超声技术的生物大分子制备方案，其优势不仅仅表现在得率，纯度，完整性等表面价值，更重要的是提升了下游数据价值：

qPCR 扩增效率提高；
医学样本如痰液中病毒核酸有效释放；
宏基因组样本有效破碎以便下游检出更多革兰氏阳性菌；
文库复杂度提升，基因密集区以及GC富含区测序深度提升；
融合基因检出提升等等。

案例解析
 
呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus, RSV）是一种RNA病毒，可导致发热、鼻炎、咽炎及上呼吸道感染等症状。在老年人患者中，病毒载量较低，为了保证检测的准确性，需要灵敏度更高的检测方法如RT-PCR法。

在呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus, RSV）的鉴定案例中，作者比较了Covaris聚焦超声技术(AFA)处理痰液结合MNAzyme探针法与Glass beads研磨方法处理痰液结合TagMan探针法对RSV病毒提取及扩增效率的影响。

结果显示，与Glass beads方法相比，经Covaris AFA超声法处理后提取的核酸样本，检测到的Ct值明显减小(变化范围1.0 - 4.0 log)，即经Covaris AFA超声法处理的样本提取的病毒RNA得率更高。尤其是在7号样品中，使用Glass beads方法处理的样本，检测RSV-B呈阴性，而Covaris方法处理的样本检测结果为阳性。（如下表）

在这个案例中，Covaris AFA超声法处理痰液的时间仅为30秒。这是因为聚焦超声技术的声波频率（500kHz）远远高于普通水浴超声，集中的能量可以在低温条件下很短时间内将病毒彻底灭活，同时充分释放病毒核酸以便提高病毒核酸得率。既可以保护检测人员的安全，又可以提高工作效率，降低假阴性概率。
 
分枝杆菌

分枝杆菌在自然界中普遍存在，在临床上，可引发个体全身或局部的破坏性感染。由于不同种类的分枝杆菌感染需要不同的治疗方案，因此菌株的快速准确鉴定对于疾病诊断和有效的抗生素治疗至关重要。

常规方法（高温灭活和珠子处理）完成一次菌株灭活及多肽提取需要95.5分钟，其中95℃灭活30分钟。约翰•霍普金斯大学的一个研究团队发现，使用聚焦超声技术完成一次菌株灭活及多肽提取仅需4.5分钟，其中18℃灭活仅需2分钟，接受测试的21个种属182份样品在2分钟聚焦超声条件下完全灭活，比传统高温灭活方法节约28分钟。

处理后的样本使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定。结果显示，利用Covaris AFA技术处理的样本鉴定所得到的平均置信度得分Log值为2.07(1.90-2.26)，而传统方法提取鉴定的平均得分为1.96(1.52-2.20)。并且，当使用≥2.0作为cut-off临界值时，AFA鉴定的准确率为66.7%，而传统方法则为41.7%；当分别以≥1.8和≥1.7作为cut-off临界值时，传统方法的准确率为66.7%和83.3%，而AFA方法鉴定的准确率为100%。（见下表）

（注：得分表示未知样品的质谱图谱与数据库中已知样品的图谱的相似程度，Log值越高，表明待测样品的细菌蛋白质鉴定的灵敏性和准确度越高）

同时作者还发现，使用Covaris AFA聚焦超声处理的菌株，在鉴定时的重复性也远远高于传统处理方法。具体表现为：在以≥1.7作为cut-off临界值时，AFA聚焦超声提取样品2-4个重复点鉴定的一致性为100%，而传统方法鉴定需要4个点的重复才能达到77.5%的一致性，2个点重复时仅有38.3%。（见下表）

综上，Covaris AFA在合胞病毒和分枝杆菌的检测和鉴定上带来的优势有：

检出率高
利用Covaris AFA超声法做样本前处理，下游提取RNA再结合MNAzyme扩增提高了对不同呼吸道样本（包括痰液）中RSV（平均2个logs）的检测。AFA处理的分枝杆菌鉴定准确率100%。

通用性好
这种通用的核酸提取方法应易于适用于任何其他呼吸道病原体（病毒和/或细菌）。

快速高效
使用Covaris AFA技术处理痰液仅需30秒，灭活裂解分枝杆菌仅需2分钟。Covaris AFA在等温条件下的聚焦超声处理可以有效减少临床样本或病原微生物样本前处理过程中的一些繁琐步骤。

安全性高
Covaris AFA 技术采用封闭的非接触式处理方式，样品在密闭的非接触体系中，避免交叉污染。样本管上的二维码标记，方便追踪记录，安全管理。

除了上述合胞病毒和分枝杆菌之外，Covaris AFA 技术在大肠杆菌、铜绿假单胞菌、酵母等样本的制备上也有优秀的表现。

推荐型号

Covaris M220采用高频率短波长的自动声波聚焦技术（AFA技术），可以进行病原微生物样本制备，还可进行DNA/RNA片段化、染色质片段化（ChIP）、蛋白质抽提、从石蜡样品中进行核酸的提取等实验，其主要技术特点为能量精准可控、等温处理、非接触处理无交叉污染等。

参考文献：

David Nauwelaersa,∗, Leen Vijgenb et al. "Development of a real-time multiplex RSV detection assay for difficult respiratory samples, using ultrasone waves and MNAzyme technology" Journal of Clinical Virology 46 (2009) 238–243

La’Tonzia, L. Adams, et al. "A Rapid Standardized Protein Extraction Method Using Adaptive Focused Acoustics for Identification of Mycobacteria by MALDI-ToF MS." Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (2016).

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