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Covaris辅助鉴定LncRNA对染色质重塑复合物的调控机制

【字体: 时间:2021年01月27日 来源:基因有限公司

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  不同的染色质重塑复合物能够在特定时间定位在特定的核小体上,通过改变染色质结构,影响基因转录活性。然而细胞是如何精准控制这些通用复合物,其中的机制却多数未知。

染色质重塑复合物(Chromatin remodeling complexes)是一类依赖DNA的,具有ATPase活性的类解旋酶蛋白复合体,根据所含功能结构域的不同,大致分为SWI/SNF、ISWI、CHD和INO80四大家族。不同的染色质重塑复合物能够在特定时间定位在特定的核小体上,通过改变染色质结构,影响基因转录活性。然而细胞是如何精准控制这些通用复合物,其中的机制却多数未知。

今天,我们为大家介绍一篇研究LncRNA调控染色质重塑复合物组成的文章:Linc-MYH configures INO80 to regulate muscle stem cell numbers and skeletal muscle hypertrophy。该文章发表在The EMBO Journal 杂志(IF9.8),通讯作者为德国马克斯普朗克心肺研究所Thomas Boettger教授,其主要研究方向是microRNA(miRNA)和长非编码RNA(lncRNA)在心血管系统和骨骼肌中的生理功能和分子机制。

文中阐述了肌肉干细胞(MuSC)中Linc-MYH与INO80复合物相互作用,控制肌肉干细胞池(MuSC pool)的细胞数量及骨骼肌细胞肥大的机制。Covaris AFA聚焦超声破碎系统被用于其中RNA-IP的细胞裂解, Covaris CP02纳米破碎仪用于免疫沉淀前的组织样品破碎。

MuSC(muscle satellite cells)即骨骼肌卫星细胞,又称肌肉干细胞,主要负责骨骼肌的损伤修复。正常生理下MuSC处于G0期静息状态,转录因子PAX7在其中起到重要作用;在损伤/病理状态下,MuSC进入G1期,表达肌肉生长因子MYOD,同时PAX7表达下调,诱导分化为肌原细胞,使肌肉组织得以修复。

文章开始,作者利用RNA测序鉴定出仅在增值和分化的MuSC中表达的一种长基因间非编码RNA,即linc-MYH。C2C12亚细胞分步分离以及RNA–FISH实验表明linc-MYH在核内呈多处分布。

接着,作者使用RNA-Protein Pull-down实验寻找Linc-MYH 在核内相互作用的表观调控因子。研究通过体外转录得到Linc-MYH序列,标记了生物素后与C2C12核蛋白提取物孵育,之后对于pull-down下来的蛋白进行MS分析。结果表明染色质重塑蛋白复合体INO80为最可能的靶点。在小鼠C2C12细胞以及人HSMM细胞中的RNA 免疫沉淀(RNA-IP)实验验证了这一结果,RT–PCR仅检测到了Linc-MYH。RNA-IP 实验中的细胞裂解作者使用了来自美国的Covaris Evolution E220,该仪器能够更加充分的释放有活性的生物大分子,提高实验成功率。

然而,Linc-MYH是否对MuSC以及骨骼肌的功能有重要影响?作者构建了linc-MYH 基因敲除小鼠,并发现突变动物骨骼肌质量及整个体重的显著增加,肌纤维横截面积增大以及肌核显著增多。进一步的免疫荧光染色表明分离的肌纤维以及胫前肌横截面上大量增加的MuSCs为Pax7-positive。这些结果表明linc-MYH 基因敲除小鼠中可能产生了更多的MuSCs与肌纤维融合导致了骨骼肌肥大。由此推断,linc-MYH具有限制MuSC pool大小及阻止骨骼肌纤维肥大的功能。

为探究linc-MYH的分子作用机制,作者又构建了linc-MYH+/+/INO80-V5 和linc-MYH-/-/INO80-V5 小鼠,并使用准确度更高的RNA原位杂交-相邻连接实验(rISH-PLA),验证了linc-MYH与INO80复合体的相互作用,同时推断linc-MYH可能限制INO80的组成实现自身调节功能。然而如何进一步验证这个假说呢?

最直接的方式还是直接构建INO80缺失的转基因动物。由此,作者构建了Pax7-Crepos /INO80-/-小鼠以及linc-MYH-/-/INO80 -/-Pax7-Crepos小鼠 (Pax7-CreposdKO),并且也使用tamoxifen诱导INO80缺失构建了linc-MYH-/-/INO80 -/-小鼠,以避免潜在的发育缺陷的影响。组织学分析表明,在linc-MYH-/-小鼠中观察到的Pax7posMuSC增多现象,在Pax7-Crepos dKO小鼠中被完全消除,同时观察到的被抵消的还有胫前肌以及整个体重的增加。

以上数据表明linc-MYH是通过抑制INO80来限制MuSC pool的大小。而linc-MYH-/-细胞中MuSC pool的扩大是怎样实现的呢?作者连续两周每天对成年动物进行EdU给药,WT鼠MuSCs中EdU的摄入增加12%。与之相比,linc-MYH-/-小鼠中的EdUpos/Pax7pos信号增加数值显著上升,说明MuSCs的增加是细胞增殖的结果,linc-MYH能够控制细胞的增殖。不过增殖后,这些细胞又回复到CalcR-positive 的静息态,同时观察到的MyoDpos/EdUpos核的数量显著增加表明是成肌细胞融合到肌纤维导致肥大。

linc-MYH对细胞增殖的控制在体外试验中也得到验证。作者从WT, linc-MYH-/-, Pax7-Crepos/INO80-/-, 和Pax7-Cre dKO 鼠中分离MuSCs进行体外培养,来自linc-MYH-/-的细胞增殖速度最快。

接下来,作者分析了linc-MYH-/-, Pax7-Crepos/INO80-/-, 和Pax7-Cre dKO鼠中MuSCs的转录组,希望能够发现潜在的调控机制。对比三个样本的GO富集结果,linc-MYH-/-的样本富集到许多YY1 和p53的靶基因,表明linc-MYH可能通过YY1 或p53对INO80起作用。在linc-MYH-/-的MuSCs中进一步敲低YY1,抵消了原有的增殖增加,也验证了这一猜测。由此作者对调控机制做了大胆猜测:linc-MYH通过控制INO80复合物的组成以及INO80与YY1的结合来调节MuSCs的丰度。但是如何验证呢?

作者使用Co-IP实验来拉取linc-MYH-/-和WT鼠骨骼肌组织中与INO80相互作用的蛋白。文章中使用了Covaris的CryoPrep CP02对小鼠骨骼肌组织做冷冻均质破碎处理。质谱分析鉴定出14个与INO80相互作用的蛋白,大多数在两种小鼠中鉴定到的量相当。但是YY1, WDR5和TFPT这三个蛋白在linc-MYH-/-小鼠中含量有明显增加。额外的pull-down和Western blot分析验证了这一结果。同时,原位相邻连接实验(PLAs)也显示在增殖的linc-MYH-/-中,YY1 和WDR5 与INO80-V5的相互作用增强。

最后,作者通过Pull-down分析了linc-MYH与人INO80 (hINO80)不同domains的结合情况,鉴定出具体的结合位点在INO80的NTD 和 HSA 两个结构域,而过去的知识表明,TFPT 和YY1也是结合在此位置。同样的方法并结合质谱分析,作者识别出linc-MYH 和INO80结合的位置在其第三、四、五外显子上。

总之,作者鉴定到linc-MYH通过与INO80的N末端部分相互作用,阻碍其他N末端结合亚基的募集,包括促增殖的YY1转录因子和TFPT,从而影响细胞增殖,控制MuSC pool的细胞数量及骨骼肌细胞肥大。

参考文献

Schutt C, Hallmann A, Hachim S, Klockner I, Valussi M, Atzberger A, Graumann J, Braun T, Boettger T. Linc-MYH configures INO80 to regulate muscle stem cell numbers and skeletal muscle hypertrophy. EMBO J. 2020 Nov 16;39(22):e105098. doi: 10.15252/embj.2020105098. Epub 2020 Sep 22. PMID: 32960481; PMCID: PMC7667881.

长链非编码RNA(LncRNA)是当前研究火热的表观遗传调控因子,通过直接相互作用,能够控制目标蛋白的定位及活性。然而,可用于研究Lnc RNA相互作用的实验方法比较有限,主要集中在RNA-IP(RIP), Pull-down,Co-IP,相邻连接实验(PLA)等。Covaris AFA聚焦超声破碎仪提供能量可控的、高得率的细胞破碎,Covaris CryoPrep CP02提供纳米级别的组织破碎,为Lnc RNA的研究保驾护航。基因有限公司作为Covaris中国区的合作伙伴和全国代理商,邀您一同关注我们的官方微信“基因快讯”。如需要进一步资料,回复本微信或直接联系基因有限公司各地办事处。

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