丁建平研究组Cell Discovery、JMCB连发三篇文章

　　

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)丁建平研究组近期发表多篇文章，分别解析了D-2-HGDH突变体在遗传学疾病D-2-羟戊二酸尿酸症发生中的作用；人源NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH, IDH3) (α2βγ)2八聚体的组装和变构调控的分子机制；Rheb疾病相关突变体Y35N和D60K调控mTORC1活性的分子机制。

“Structure, substrate specificity, and catalytic mechanism of human D-2-HGDH and insights into pathogenicity of diseases associated mutations”这一研究结果发表在国际学术期刊Cell Discovery上。该工作揭示了人源FAD依赖的D-2-羟戊二酸脱氢酶（D-2-HGDH）对底物特异性识别和催化反应的分子机制，阐述了D-2-HGDH突变体在遗传学疾病D-2-羟戊二酸尿酸症发生中的作用。

2-羟戊二酸（2-HG）是正常细胞代谢过程中一些酶促反应的副产物，根据连有羟基的第二位碳原子的手性不同，分为D型和L型。体内2-HG的过度积累会导致2-羟基戊二酸尿症（2-HGA），并与多种恶性肿瘤相关。人线粒体中存在二种功能酶—D-和L-2-HG脱氢酶（D-和L-2-HGDH），它们以FAD为辅酶分别催化D-和L-2-HG氧化脱氢生成2-OG，从而将细胞内的2-HG含量保持在一个较低的水平（约<100mM）。2-HGA是一种罕见的常染色体隐性遗传神经代紊乱性疾病，以患者的血、尿及脑脊液中2-HG浓度升高为主要特点；临床上根据病人尿液中2-HG的种类，可以分为D-2-HGA、L-2-HGA以及混合型D,L-2-HGA三种类型。患者在临床上表现为不同程度的发育迟缓、智力减退、癫痫、脑部异常等症状，该病目前尚无有效的治疗手段。D-2-HGDH基因突变使得D-2-HGDH的功能损伤，导致D-2-HG的积累，进而引发I型D-2-HGA。异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）突变后获得新的催化活性，能将2-OG还原成D-2-HG，也导致D-2-HG在细胞中大量积累，引发II型D-2-HGA。另外，D-2-HGDH的基因突变也与弥散性大B细胞淋巴瘤的发生相关。目前，对D-2-HGDH特异性识别底物和发挥催化功能的分子机制、以及突变与疾病发生的关系还不清楚。

丁建平组博士研究生杨俊和朱涵文首次解析了人源D-2-HGDH结合FAD以及结合底物D-2-HG、D-苹果酸、D-乳酸、L-2-HG和2-OG的晶体结构。结构分析表明，D-2-HGDH包含一个FAD结合结构域、底物结合结构域、以及C-末端结构域；活性反应中心位于FAD结合结构域和底物结合结构域的界面上。进一步运用生化方法对参与辅酶和底物结合以及催化反应的关键氨基酸残基的功能进行了验证。基于结构和功能分析结果，揭示了D-2-HGDH对底物特异性识别和催化反应的分子机制，阐述了D-2-HGDH突变体在疾病发生中的作用。这一工作也为临床药物设计以及疾病治疗提供了结构基础和理论依据。

“Structure and allosteric regulation of human NAD-dependent isocitrate dehydrogenase”一文揭示了人源NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH, IDH3) (α2βγ)2八聚体的组装和变构调控的分子机制。

异柠檬酸脱氢（IDH）负责催化异柠檬酸(ICT)氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)，是三羧酸循环中重要限速酶。在人和其他高等真核生物细胞中，存在依赖于NADP和NAD二种辅酶的IDH（NADP-IDH和NAD-IDH）。人源NADP-IDH有二种，分别定位于细胞质和线粒体中（IDH1和IDH2），它们在细胞氧化损伤和脂类合成中发挥重要作用。近期研究表明，IDH1和IDH2在活性反应中心关键氨基酸的突变导致原有酶活的丧失，但产生了一种新的催化功能，与多种肿瘤的发生发展直接相关。人源NAD-IDH（IDH3）定位于线粒体，在三羧酸循环中发挥功能。

丁建平研究组前期对NADP-IDH做了大量的研究工作，相继解析了人源IDH1 (J. Biol. Chem. 2004)、IDH1 R132H突变体 (Cell Res. 2010)和酵母线粒体NADP-IDH (Protein Sci. 2008)的结构，揭示了这些酶发挥催化反应的分子机制。近年来，致力于人源NAD-IDH（IDH3）的结构、功能和调控机制的研究。对人源IDH3的生化研究表明，人源IDH3由α, β和γ三个亚基组成，它们组成αβ和αγ两个异源二聚体，再组装成α2βγ异源四聚体，并进一步组装成八聚体；αγ二聚体和α2βγ四聚体具有类似的酶学性质，都能够受到一系列代谢小分子的异构调控，但αβ二聚体不能被调控；在α2βγ四聚体中，α亚基发挥催化功能，γ亚基发挥调节功能，而β亚基只发挥结构功能（Sci. Rep. 2017a）。进一步的结构和功能研究揭示了αγ二聚体能够被CIT、ADP和低浓度ATP激活、NADH和高浓度ATP抑制，而αβ二聚体不能被代谢小分子激活但能被NADH抑制的分子机制。但到目前，人们对αβ和αγ两个二聚体是如何组装成α2βγ四聚体、并进一步组装成八聚体并发挥协同功能的分子机制还不清楚。

丁建平研究组成功解析了人源IDH3八聚体(α2βγ)2在未结合底物和配体（Apo）、处于非激活状态下的晶体结构。结构和功能分析表明，αγ和αβ通过clasp结构域相互作用形成α2βγ四聚体，两个四聚体再进一步通过γ亚基的N端插入到β亚基的back cleft组装成稳定的八聚体(α2βγ)2。通过这种组装方式，4个催化α亚基处于IDH3八聚体的外侧，有利于底物ICT和辅酶NAD的结合和催化反应的进行。γ亚基通过αγ-αβ相互作用界面的clasp结构域将变构调控信号传递至两个催化亚基。γ亚基的N端与β亚基的相互作用不仅在八聚体的组装中起决定作用，还在四聚体-四聚体相互协同功能中发挥重要作用。该工作不仅阐明了人源IDH3全酶的组装机制和别构调控机制，也为研究其他高等真核生物NAD-IDH的组装和调控机制提供了基础。

12月20日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）丁建平研究组在Journal of Molecular Cell Biology发表了题为“Molecular basis for the functions of dominantly active Y35N and inactive D60K Rheb mutants in mTORC1 signaling”的论文，该研究揭示了Rheb疾病相关突变体Y35N和D60K调控mTORC1活性的分子机制。

mTORC1信号通路通过感受和整合外界信息，如生长因子、能量状态和营养水平等，调控多种生命过程。在氨基酸信号的刺激下，一系列蛋白质及复合物共同发挥功能，通过Rag GTPase将mTORC1招募到溶酶体膜上，使其被定位于溶酶体膜上的小G蛋白Rheb结合并激活。与其它小G蛋白类似，Rheb主要依靠结合GTP和GDP状态的循环过程中switch 区域的构象变化、发挥分子开关功能，并通过switch区域与mTOR激酶相互作用进而别构调控mTORC1的活性。Rheb在switch区域的突变直接影响了其对mTORC1信号通路的激活，如近期在多种肿瘤组织中被鉴定出的RhebY35N突变体，能够在细胞饥饿状态下表现出对mTORC1较高的激活作用；而失活型突变体RhebD60K无论在营养充足或饥饿条件下均不能激活mTORC1。但这些突变导致Rheb功能发生变化的分子机制均不清晰。

丁建平研究组长期从事mTORC1信号通路调控的分子机制研究，先后解析了该信号通路中一些重要调控蛋白包括Rheb、S6K1、CASTOR1和Ragulator复合物的晶体结构，揭示了它们在mTORC1信号通路中发挥功能的分子基础。前期工作中他们解析了Rheb-GTP和Rheb-GDP的晶体结构。在此基础上，丁建平研究组的博士生张春笑和张天龙研究员进一步解析了RhebY35N-GppNHp、RhebY35N-GDP和RhebD60K-GDP的晶体结构。结构分析和体外功能实验结果表明，在RhebY35N-GppNHp和RhebY35N-GDP结构中，switch I区域均“模拟”了RhebWT-GTP中的构象，导致RhebY35N无论结合GTP还是GDP均能与mTOR结合并激活mTORC1；而D60K的突变导致RhebD60K只能处于结合GDP的失活状态，并且RhebD60K-GDP结构中switch I区域的构象与RhebWT-GDP中的类似，因此无法激活mTORC1。

该工作揭示了与疾病相关的Rheb突变体调控mTORC1活性的分子机制，有助于阐明mTORC1信号通路功能失调与相关疾病发生发展的关系，为针对这些突变体的药物设计提供了结构基础和理论依据。