TCR-Seq方法怎么选,一篇54分SCI文章的深度测评值得关注!

【字体: 时间:2021年11月01日 来源:Takara

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  巴黎索邦大学的Barennes团队评估了市面上9种TCR-Seq方法,并将实验结果发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

或许您也注意到,最近几年,国内外越来越多的科研人员投身于免疫组库研究的阵营。通过了解T细胞,研究人员可以洞悉免疫系统的复杂性。研究T细胞功能必不可少的是T细胞受体(TCR),它们选择性地结合抗原呈递细胞 (APC) 表面主要组织相容性复合体 (MHC) 分子的特定抗原。TCR的抗原识别激活T细胞,使它们快速增殖并通过释放细胞因子产生免疫反应。

在众多的TCR研究方法中,NGS技术逐渐成了TCR主流的分析方法。但市面上TCR-Seq的方法琳琅满目,每种方法之间的细微差别也会使得实验结果大不同。所以如何选择合适的方法成为摆在研究人员面前的难题。巴黎索邦大学的Barennes团队1评估了市面上9种TCR-Seq方法,并将实验结果发表在《Nature Biotechnology》杂志上(后文会详细阐述)。

TCR-Seq的相关背景

▪ 起始材料 DNA or RNA?

大多数TCR-Seq方法可以根据起始材料大致分为基于DNA的方法和基于RNA的方法。基于DNA的方法,优点是每个细胞只有一个模板,更适合于单个TCR克隆的定量,但这也可能会导致TCR-Seq成本较高。而基于RNA的方法更加灵敏,能够定量预估TCR丰度和基因表达,并且容易结合分子标签(UMIs),减少PCR偏倚,提高对稀有变异的准确鉴定。

▪ 建库策略

常用的两种方法是mPCR (多重PCR)和5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)。

mPCR支持DNA和RNA起始,通常包括两轮PCR。第一轮PCR可扩增出受体基因座,并添加用于二轮PCR引物位点的已知序列,测序接头与index随后整合。然而,第一轮PCR overlap sites的引物位点存在高多样性,需大量简并引物,因此易引入PCR bias。而5’RACE技术只适用RNA作为模板,每轮PCR仅需一对引物,能显著降低PCR偏差,确保结果反映样本的真实情况。

文献解读

选择 TCR-Seq方法时需要考虑四个关键因素:再现性、重复性、灵敏度和特异性。Barennes团队系统地比较9种TCR-Seq方法,包括3个基于多重PCR以及6个基于5 ' RACE-PCR的方法。其中使用相同的细胞样本以便尽可能减少由于样本不同而引起的差异。在本实验中采用匿名化处理,将5' RACE-PCR方法标记为RACE-#,将mPCR方法标记为mPCR-#。 结果表明,本次测试的9种方法中,研究人员注意到有3种TCR-Seq方法表现更好:mPCR-1、RACE-3和RACE-5。

分析不同的TCR-Seq方法的重复性和再现性

研究团队比较了不同TCR-Seq的重复性(即不同样本采用相同方法获得的数据之间的相似性)和再现性(即不同方法获得的数据之间的相似性)。热图的结果表明,RACE-3在TRA和TRB的重复性和再现性方面均名列前茅,始终都排在前两名。对于TRA,RACE-5的再现性高于RACE-3,但重复性低于RACE-3。对于TRB,RACE-3的再现性最好,而mPCR-1的重复性最好。(注:mPCR-1没有TRA信息,RACE-5没有TRB信息,但RACE-3同时提供了TRA和TRB信息。)

分析不同的TCR-Seq方法的灵敏度和特异性

接下来的测评是针对灵敏度和特异性。在TCR-Seq中,灵敏度是对真正稀有克隆型和变异频率的准确量化。 同样,特异性可以将测序错误与真正的罕见变异区进行区分。为了评估每种方法捕获所有克隆型的能力,研究人员从同一细胞样本的108个重复(45个TRA和63个TRB)中生成了一个silico meta-repertoire。为了最大程度地减少偏差,采取了以下步骤:将这9种方法获得的dataset中的所有克隆型合并,去除单例,仅选择未进一步处理(pre-UMI integration)的dataset,并对dataset大小进行归一化处理。采用Meta-repertoire clonotype (MRC)定量方法比较各种方法的灵敏度。

RACE-3生成的dataset包含了多达50%的TRA和高达40%的TRB的MRCs,相比之下,其他RACE方法的MRCs为10-20%(文献中Figure 5, Panel A)。对于TRA,RACE-5也有较高的MRCs。对于TRB,mPCR-1也具有较高的MRCs。就每个重复捕获的MRCs的百分比而言,RACE-3在9个重复中捕获了高达40%的MRCs,但未能检测到低于1%的MRCs(文献中Figure 5, Panel B)。RACE-5和mPCR-1对TRA和TRB的表现与RACE-3相似。对于TRA, RACE-3的9个重复中检测到MRCs的频率在1%到0.001%之间,其他方法的频率在1%到0.05%之间(文献中Figure 5, Panel C, left),而在任何重复中未检测到克隆型的丰度低10到100倍的情况。TRB也有类似的情况。RACE-3和RACE-5表现出更高的灵敏度,因此能检测到更高比例的低丰度克隆型,尤其是TRA。

结论

在这些TCR-Seq方法中,稀有克隆的多样性和检测高度依赖于起始材料的类型和数量。多重PCR方法更适合检测克隆型多样性,但重复性较低,而5’RACE-PCR则可以更准确地定量特异性克隆型的丰度。对于后者,作者建议使用基于UMI的方法可以提高准确性。数据指向了三种得分高的方法:mPCR-1是A公司的平台;RACE-3是Takara Bio 的 SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit;RACE-5是由Eugster2等人开发的自制方法。


小编总结:

虽然Eugster团队的方法在最终的分析中被认为是进行TRA分析时重复性最佳的方法,但SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit的灵敏度,与Eugster团队方法以及A公司的平台具有可比性。SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit可以提供同时分析TRA和TRB的选项,而且与其他8种方法相比,它在重复性、可靠性和灵敏度方面始终排名很高。 并且SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit 在TRA和TRB 的可靠性以及TRB重复性位列第一。

Takara Bio一直致力于为我们的客户提供高品质、创新的产品。我们改进了本研究中使用的TCRv1试剂盒,发布了新的SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2,其中特别添加UMI和UDI,正如本文作者建议的那样。


SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2(TCRv2)

• 支持10 ng-1 μg外周血淋巴细胞来源或1 ng-100 ng T细胞来源的total RNA,以及纯化后完整的1,000-10,000个T细胞起始;
• 添加UMI与UDI建库,用以校正错误reads、减少index hopping,结果更可靠;
• 可自由选择Miseq平台(分析V(D)J 全长),或是其它Illumina平台(分析CDR3);
• 流程完整,使用Cogent NGS Immune Profiler Software可完成测序数据分析。


从实验结果来看,添加UMI能将掺入的Jurkat RNA TRBV12-3克隆型的检测极限下探至0.001%!


与同类型产品比较,TCRv2文库所获得的克隆型数量远高于Company X RNA法及Company Y DNA法的结果。
(数据来源于Takara Bio USA, Inc.)

希望本期分享内容,能帮助您选择到合适的TCR-Seq建库方案!

参考文献

1. Barennes, P. et al. Benchmarking of T cell receptor repertoire profiling methods reveals large systematic biases. Nature Biotechnology, 1–10 (2020).
2. Eugster, A. et al. Measuring T cell receptor and T cell gene expression diversity in antigen-responsive human CD4+ T cells. Journal of Immunological Methods, 400–401(1), 13–22 (2013).

延伸阅读:50篇20分↑文章,网友:免疫组库分析要火?!

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