RNA测序入门指南，这些经验请收好

如今，许多实验室都打算采用RNA测序技术来了解细胞内的转录组变化。不过，这些测序实验成本较高、费时费力，而且需要培训才能顺利完成。因此，在开展RNA测序实验前，您有必要思考一些关键问题，以便做出正确的决策。

确定测序类型

在开始RNA测序实验之前，您要回答的第一个问题是：“我需要哪种类型的测序？”大量细胞RNA测序（bulk RNA-seq）测定的是整个组织样本的基因表达平均水平，而单细胞RNA测序（scRNA-seq）则是在单个细胞水平上测定基因表达。具体选择哪种技术，需要从时间、成本、工作量和信息量的角度来考虑。

哈佛医学院单细胞核心实验室的主任Mandovi Chatterjee博士表示：“大量细胞测序对于比较转录组学和生物标志物研究非常有用，但无法捕捉组织的异质性。复杂样本中的组成细胞类型及其丰度只能通过scRNA-seq来分析。”因此，scRNA-seq适合在时间进程研究、发育研究和谱系追踪中分析特定细胞群的基因表达变化。

若某个样本的细胞异质性高，则scRNA-seq可以更好地观察到变化。以色列魏茨曼科学研究所的研究生Yonatan Katzenelenbogen正采用scRNA-seq来开展免疫学研究，他是Ido Amit博士实验室的成员之一。

根据Yonatan的说法，细胞框架取决于细胞类型和细胞状态。“了解到不同细胞类型中的细胞状态，就可以回答一些有趣的生物学问题，而大量细胞测序会失去这种复杂度，”他说。不过话说回来，scRNA-seq的成本更高，灵敏度更低。如果可以通过细胞表面标志物来分选样本中的不同细胞群，那么也不一定要开展scRNA-seq。

选择合适的平台

如果选择了scRNA-seq，那么新问题又来了：选择哪个平台呢？目前有多个平台可以开展这种分析。有些测序反应是在反应孔中进行（如CEL-Seq、MARS-Seq、SMART-Seq、SCRB-Seq和Quartz-Seq），有些在纳米孔/微孔中进行（Seq-well），有些反应则是在微滴中进行（InDrops和DropSeq）。一些平台适合高通量分析，而另一些则更适合低通量的应用。

对于任何平台而言，通量和灵敏度之间始终存在权衡。通量指的是可以分析的细胞数量，而灵敏度是指可检测到的RNA分子的数量。通量越高，则灵敏度越低。同时，平台的选择还取决于样本类型和实验需求。

“高通量测序有利于观察组织中的整体异质性，或检测稀有的细胞亚群，这需要分析大量细胞或样本，”Chatterjee博士说。不过，当样本量有限时，自然无法开展高通量测序。对于需要全长转录本的研究，高通量测序也不理想。

优化实验方案

每个scRNA-seq的流程都包括样本制备、添加条形码、文库生成、测序，以及数据分析。样本制备是将组织样本解离成单细胞悬液，以便对细胞进行分选、裂解并添加条形码。Chatterjee认为：“样本制备无疑是获得高质量数据的关键一步。高质量的样本是scRNA-seq取得成功的先决条件。”

它需要的是碎片和团块尽量少的单细胞悬液。理想的状况是细胞存活率在90%以上，且细胞膜保持完整，直到它们被包裹起来。“在添加条形码之前，细胞最好保持存活状态。尽管我们也运行过一些活力很低的样本，但裂解细胞产生的漂浮RNA会导致背景噪声更高，这意味着更多读数被浪费，”Chatterjee谈道。

奥地利科学院分子医学研究中心的博士后研究员Thomas Krausgruber博士正采用大量细胞和单细胞RNA测序来研究结构细胞的免疫力。他从皮肤、肺、肝脏和大脑等12个器官中分离出结构细胞（内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞），然后通过FACS对其进行纯化。

“我们必须优化我们的分离方案，以确保从每个器官中获得高质量且高活力的样本，”他说。通过这种方式，他能够解析结构细胞的器官特异性免疫适应，以及结构细胞与免疫细胞之间的复杂相互作用。

Katzenelenbogen 也承认，一些解离方案往往会富集或去除某些细胞群。于是，在启动一个新项目之前，他们会比较各种解离方案，看看哪一种能够在保持细胞异质性方面提供最佳的结果。目前有许多不错的在线资源，可以提供组织特异性的实验方案。而且在测序前后进行质量控制，也有助于获得好结果。

当然，在开展scRNA-seq实验时，批次效应的确是一大挑战。在分析患者样本或开展时间进程或扰动研究时，批次效应通常是无法避免的。它的原因有很多，可能来自操作人员、样本制备、试剂批次不同、实验动物、不同的测序运行等等。

您可以采用相同的操作人员和同一批试剂，合并制备文库和测序，添加条形码来混合样本以及使用生物学重复，从而尽量减少批次效应。“当单个样本中含有足够的内部复杂度来鉴定转录变化的来源时，批次效应的校正效果最好，”Chatterjee博士说。

在设计实验时，您还需要考虑的一个重要问题是：需要分析多少个细胞，以及测序深度要达到多少。“一般的经验法则是，您需要50-100个带有独特转录组特征的细胞才能在t-SNE图中形成一个清晰的簇，”Chatterjee说。越是稀有的细胞群，对细胞数量的要求越高，对测序深度的要求也越高。当然，成本也就越高。“这需要达到一个良好的平衡。因此，有时人们从较低的深度开始，然后看看数据，再决定深度要达到多少，”他补充说。

最后，当然还是要考虑资金和资源限制，以确定要投资的平台以及要运行的样本数量。“每个实验都需要一些个性化的关注。对别人有用的东西不一定适合你，”Chatterjee总结道。

如何获得高质量的测序样本？

▪ 尽可能缩短样本制备的时间
▪ 在样本制备过程中保持低温
▪ 采用优化过的最佳解离方案
▪ 让裂解条件尽可能温和
▪ 采用耗时少的方案和较大的喷嘴进行细胞分选
▪ 减少离心和重悬的时间
▪ 通过过滤或密度梯度离心去除碎片
▪ 在最后的缓冲液中加入BSA或FBS
▪ 开展试点实验，确保一切顺利