利用AI 技术对蛋白质治疗剂中的颗粒进行高级表征

在USP < 787 >中对颗粒物的数量有着严格的相关规定，并且提出了明确的评估标准。FDA以及CFDA也提出了对生物药物中不同大小颗粒（0.1-1um、1um-100um）的计数规定。治疗性蛋白质注射剂和相关制剂的制药公司需要严格遵守成药产品中颗粒物数量相关的严格规定，确保产品质量和安全性。

生物制药中的颗粒分为肉眼可见和肉眼不可见的颗粒，肉眼看不见的蛋白质颗粒是蛋白质治疗剂的重要质量属性，并且由于其潜在的免疫原性，在生物药的开发中越来越强调监测蛋白质颗粒的的重要性。而硅油滴是预填充注射器（PFS）中常见的成分，PFS是用于患者自行操作的治疗手段的首选包装形式，硅油用于润滑PFS的内筒，使柱塞平稳地移动，柱塞也可能会以类似硅油滴的形式溶解于溶液中。

硅油在过去一直被认为是无毒的，但近年来一些报告表明硅油可能具有免疫刺激性，尤其是在与蛋白质相互作用后，使蛋白质颗粒的定量变得更复杂，一种假说认为硅油滴可能通过吸附蛋白质而充当佐剂，从而导致蛋白质解折叠和还原免疫耐受性。因此通常需要在蛋白质治疗剂中添加表面活性剂，以阻止蛋白质吸附到硅油滴上。同时，须优化表面活性剂的浓度以最小化其降解产物的形成。

由此可见，对于那些存储在PFS中的生物制剂产品而言，准确定量蛋白质颗粒、确定蛋白质和硅油颗粒的比例对于衡量颗粒物质的风险至关重要，而评估蛋白质对硅油滴的吸附程度也将有助于蛋白质治疗剂配方的设计和优化。

过去，通过使用FM（flow microscopy）鉴别与颗粒大小、形状和质地有关的参数或特征来对亚可见颗粒进行分类。这些参数或特征可以单独使用，也可组合使用从而区分感兴趣的类别，这种基于参数分类方法的主要缺点是将形态图像细节压缩为数值列表，不够具体形象。

区别于上述这种参数分类，基于卷积神经网络（CNN）进行的深度学习方法可以模仿人脑的架构进行模式识别，这种分类模式已在多种行业中被广泛应用于图像分析，具有非常广阔的应用前景。例如在利用FM测量治疗制剂亚可见颗粒的分类中，结果表明，对相同的测试样品进行学习训练和验证后，可以对小至1 um的颗粒进行精确分类，但是对于未经过深度学习的独立样品，得到的分类精度却不一致。

那些能够以较小的光学像差收集较高分辨率图像的仪器，可以实现对分类精度的实质性改进。通过显微镜方法进行颗粒分类，其结果的好坏很大程度上依赖于收集图像（光学，流体和相机）的硬件条件以及由此产生的图像分辨率。商业化的FM系统不配备精准的颗粒聚焦元件，并且由于物镜放大和视场深度之间的反比关系，不得不在图像分辨率、焦距和采样效率之间权衡。曾观察到的有趣现象是，使用放大倍数更高的FM系统，却观察到更低的分类精度，部分原因可能是较难找到清晰的焦点。

此前，Luminex公司的技术研发团队通过与FM对比，发现利用Amnis成像流式细胞仪（IFC，Imaging Flow Cytometry）可以获得更高分辨率的亚可见颗粒图像。成像流式细胞术是一种新兴的制药学方法，能够从悬浮样品中同时捕捉单个颗粒的高分辨率明场图像（BF）、侧向散射光（SSC）和荧光（FL）图像，并通过流体动力学来聚焦、放大物镜景深范围内的颗粒，从而能够以更高的放大率来收集焦点图像。

最近一项发表在《Journal of Pharmaceutical Sciences》上的研究，基于Amnis®成像流式系统的人工智能（AI）软件开发出了基于CNN架构的分类模型（图一），该模型使用IFC收集的明场图像将硅油滴与蛋白质聚集体区分开。为了能够将AI模型转换到实际的蛋白质治疗剂的检测中，研究人员在保证仪器精准度的前提下，利用该模型对多种来源的蛋白质（BSA、ETFE蛋白标准品、IgG）和硅油颗粒样本 (不同注射器来源、硅油样本) 进行了分析，从而确定了粒径的分界值。模型分类结果表明，除BSA以外，对于>2μm的颗粒，其分类精度均超过95％，>4μm的所有颗粒（包括BSA）分类精度均超过95％。2-3μm的BSA颗粒的分类精度为80％，3-4μm的颗粒分类精度为89％（图二a）。镜检发现，错误分类的BSA颗粒在形态上与硅油比较相似(图二b),相较于之前的高级分类方法，本研究中开发的AI模型分类对于<5μm的颗粒分类精度与之相当甚至更高。

图一 基于Amnis®AI的分类模型

 
图二 Amnis®AI的分类

IFC的一大优势是，可以使用正交方法（AI和FL）在同一数据集上同时对颗粒进行表征，提高了分类精度，并对其进行验证。为了表征硅油滴与蛋白质的相互作用，使用IFC收集的荧光图像，将AI模型中鉴定出的硅油细分为单独硅油滴和蛋白质吸附的硅油滴，并通过对蛋白质聚集体、硅油滴和蛋白质吸附的硅油滴的分类，来确定阻止蛋白质吸附到硅油滴上所需的最低表面活性剂(PS80)的浓度。

图三 将硅油混合物加入到IgG样本中，分别检测三种分类：SO-O(仅硅油)、 SO-P（硅油蛋白聚集体）、 NSO（非硅油的蛋白聚集体）
a.混合样本中加入了0.1% PS80的检测结果     b.混合样本中未加入0.1% PS80 的检测结果，其中的SO-P含量明显高于a    c.三种分类：SO-O 、SO-P、 NSO的代表性图像

图四  a.不同PS80浓度（0.1%、0.05%、0.025%、0）下检测到的三种分类的对比，加入0.1%PS80的样本中的SO-P含量最低  b.不同PS80浓度下检测到的硅油-蛋白质聚集体的代表性图像

原文检索：

• Probst C, Zayats A, Venkatachalam V, Davidson B. Advanced Characterization of Silicone Oil Droplets in Protein Therapeutics Using Artificial Intelligence Analysis of Imaging Flow Cytometry Data. J Pharm Sci. 2020 Oct;109(10):2996-3005.

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