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行远自迩,踔厉奋发—PCR基础知识介绍(一)

【字体: 时间:2021年03月26日 来源:Takara

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  本期讲堂,作为PCR基础知识的开篇,我们先来了解一下最基础的PCR原理、操作流程、成功的要素这三部分内容。

PCR作为一项基础的分子生物学技术,由于操作简便、省时、灵敏度高等优点,在生物科学研究领域应用广泛:从克隆、基因编辑、下一代测序(NGS)到基因分型、法医侦查、病原鉴定等,都离不开PCR技术的助力分析。

行远自迩,踔厉奋发,笃行致远,砥砺深耕。Takara作为提供PCR制品的重要企业,为了满足众多研究人员的需求,也在一直不断地完善与进步。以匠人精神,致力于新产品的开发;以专业的精神,严谨科学的态度,分享PCR基础知识。

本期讲堂,作为PCR基础知识的开篇,我们先来了解一下最基础的PCR原理、操作流程、成功的要素这三部分内容。

一、PCR原理

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的英文首字母缩写,它是一种体外扩增的方法,通过DNA链的热变性、引物退火和聚合酶作用下引物的延伸三个步骤,循环往复,达到在短时间内大量扩增目的基因的目的。

理论上,每一轮循环可使DNA的数量增加一倍,经过n次循环后,反应混合物中所含的DNA数量为2n。

二、PCR操作流程

①DNA制备

从样品中提取PCR反应所需的DNA模板、直接PCR无需此步。
推荐商品化的核酸提取试剂,节省时间、简化操作流程、减少DNA提取量的损失。

②PCR反应

包括反应液的制备和PCR反应两个步骤。

反应液的制备
普通PCR的反应体系由DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板这五大要素组成。商品化的DNA聚合酶,一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应缓冲液,因此仅需我们准备引物及DNA模板,并且根据说明书推荐量进行反应液配制即可。

PCR反应
选择适宜的梯度PCR仪,根据扩增片段大小及酶制品说明书推荐来进行PCR反应条件设置。

③电泳、染色

PCR反应后,通过凝胶电泳确认扩增片段大小。

三、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板是构成PCR反应组分的五大要素,这是影响PCR成功的内因;PCR反应条件的设置,是影响PCR成功的外因。

酶、buffer(Mg2+)、dNTP

之前提到过商品化的DNA聚合酶,一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应buffer,因此酶的选择至关重要,我们需要兼顾保真性、扩增特异性、扩增速度、扩增效率、模板复杂程度及扩增片段长度等,选择最适PCR酶。

引物

PCR反应引物的终浓度一般在0.1μM~1μM之间。引物浓度低,扩增产物少;引物浓度高,容易出现非特异扩增及引物二聚体。

PCR引物的设计,一般要遵循如下的设计原则:

模板

模板的完整性要好,模板降解会导致PCR扩增无产物。同时模板纯度也尽量越纯越好,纯度不好,可用PCI(苯酚氯仿抽提)及EtOH(乙醇沉淀 )精制。

模板添加量可以参考酶制品说明书及下表的建议模板量进行添加,加量过多会导致非特异性扩增产物增加:

反应条件

PCR反应条件可以参考酶制品说明书及下表进行设置:


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