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当单细胞遇到PacBio Iso-Seq

【字体: 时间:2021年04月13日 来源:基因有限公司

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  随着科学家们采用PacBio Iso-Seq方法来进行转录组学的探索,越来越多的研究表明采用这种长读长高准确度的测序方法发现了更多的转录多样性,而以往NGS短读长测序技术大大低估了生物转录的多样性。

人们对基因组学的进一步研究和了解,改变了我们对于科学的认知,同时转录组研究也随着探索遗传变异的功能影响而快速的得到了发展。尽管生物体的不同组织可能共享相同的基因组DNA,但是它们转录成RNA的过程或RNA编辑过程中可能存在很大的差别。选择性可变剪切影响了哺乳动物中几乎所有的基因,大大扩展了蛋白质组的多样性,增加了细胞类型的功能多样性。

传统RNA测序

最初,人们采用Northern blot以及芯片的方法来研究基因表达的多样性,但它们的局限在于只能研究已知的转录本,对多转录本之间的细微差异难以破译。随着下一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)的发展,研究人员有能力利用RNA-seq来对基因的表达进行进一步的探索,但是由于NGS读长的限制,科学家们必须通过拼凑和组装来获得一条完整的转录本,但是我们知道,一个基因可以通过不同的可变剪切从而得到不同的isoform,所以NGS在转录本测序中的准确性还有待商榷。


The RNA-Seq approach yields reads that do not span multiple exon junctions.

全长转录本测序

利用PacBio Iso-Seq测序技术,科学家们可以获得高准确度长读长的HiFi reads(QV>99%, reads length >10kb),一条reads可以轻松覆盖完整的isoform,而不需要进行组装等生物信息学分析。随着科学家们采用PacBio Iso-Seq方法来进行转录组学的探索,越来越多的研究表明采用这种长读长高准确度的测序方法发现了更多的转录多样性,而以往NGS短读长测序技术大大低估了生物转录的多样性。


HiFi reads enable sequencing of full-length transcripts that span all exon junctions
so that transcript assembly is not needed.

单细胞全长转录本分析

单细胞RNA测序(scRNA-Seq)技术已成为解决发育生物学、肿瘤学、神经科学、免疫学和许多涉及复杂生物学和病理过程中细胞异质性研究的强大工具。目前常用的scRNA-seq技术依赖于下一代测序(NGS)平台,尽管成本较低,但它们不能解析复杂的转录本异构体、选择性剪切、嵌合转录和序列多样性。PacBio单细胞RNA测序使用Iso-Seq方法,可以在单细胞水平区分转录本异构体。高准确度的长读长HiFi reads可以跨越转录本的整个5 '到3 '端,对转录本多样性进行高分辨率解析,并揭示细胞间的异质性,而不需要组装。

案例一

研发人员在Dolomite Nadia平台上生成了黑猩猩和人类大脑类器官样本的单细胞Iso-Seq (scIso-Seq)库,并在PacBio Sequel II系统上分别用两个SMRT 8M芯片对每个库进行测序。作者开发了一个生物信息学pipeline,在单细胞水平上识别、分类和过滤全长转录本。研究发现,scIso-Seq揭示了全长转录本信息,即可以揭示不同细胞类型和不同物种之间的差异,而这些信息不能通过短读长测序技术来获取。


Alternative transcription start site (TSS) usage in chimp and human in ZNF3311

案例二

HIT-scISOseq在单个SMRT 8M芯片上生产> 1000万个高精度全长isoform,在Sequel II系统上进行高通量单细胞全长转录本测序。通过被生物素标记的PCR 引物来捕获全长cDNA以及创新的头到尾连接步骤,HIT-scISOseq提供了比标准单细胞RNA测序protocol多8倍的数据输出。


HIT-scISOseq workflow and performance. (A) Overview of the 10X Genomics single-cell 3 full-length cDNA library construction. (B) PCR reaction is used to amplify full-length cDNAs with a 4 biotinylated 3’ primer. (C) The biotinylated full-length cDNAs are enriched by streptomycin magnetic 5 beads. (D) Restriction digestion at both ends to produce sticky end by USER enzyme. (E) Ligation of the 6 cDNAs. (F-G) End repair, dA tailing, adapter ligation, and PCR enrichment of the ligated cDNAs, followed 7 bySMRTbell library preparation. 2

案例三

通过对出生后第7天小鼠海马和前额叶皮层45种细胞类型进行单细胞长读长转录本测序,我们首次对大脑区域间差异转录本表达(DIE)进行了单细胞研究(www.isoformAtlas.com)。使用包括转录起始位点(transcription start site, TSS)和polyA数据在内的全长转录本信息,395个基因在海马和前额叶皮层细胞中表现出显著差异,而使用短读长数据,只有31个基因符合相同的标准。在下图中,Nsfl1c中的6nt微小外显子(橙色)在神经元和胶质细胞类型的海马中优先表达,但在相同的前额叶皮层细胞类型中不存在。


Isoform expression of Nsfl1c gene. Each horizontal line in the plot represents a single transcript colored according to the cell-type it is represented in. Therefore, blocks represent exons and whitespace represent intronic space (not drawn to scale). 3

参考文献
1. SINGLE-CELL RNA SEQUENCING WITH HIFI READS BEST PRACTICES
2. Zheng, Y.-F., et al. (2020) HIT-scISOseq: High-throughput and high-accuracy single-cell full-length isoform sequencing for corneal epithelium. bioRxiv Preprint.
3. Joglekar, A., et al. (2020) Cell-type, single-cell, and spatial signatures of brain-region specific splicing in postnatal development. bioRxiv Preprint.

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基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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