RT-PCR入门:基础知识及产品推荐

【字体: 时间:2021年04月22日 来源:Takara

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  RT-PCR技术灵敏且用途广泛,可应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种研究领域。今天小编就带大家来详细了解一下这项技术,感兴趣的老师不要错过哦!

  

虽然原理上PCR需要以DNA作为模板,RNA不能直接被扩增,但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后,PCR法便可应用于RNA的解析了,这就是今天我们要介绍的RT-PCR技术。

RT-PCR技术灵敏且用途广泛,可应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种研究领域。今天小编就带大家来详细了解一下这项技术,感兴趣的老师不要错过哦!

一、RT-PCR原理

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和以cDNA为模板的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。整个反应过程分为两步,第一步是经反转录酶的作用,从RNA合成cDNA的过程;第二步是以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下扩增目的片段的过程。

我们以PrimeScript RT-PCR Kit(Code No.RR014)为例,来看一下RT-PCR反应的原理图:

二、一步法 or 两步法RT-PCR

RT-PCR原理中介绍了整个反应过程分为两步,根据这两步反应是否在单管中操作,可以将其细分为一步法(One-step)RT-PCR和两步法(Two-step)RT-PCR两种,两者的区别与特点汇总如下:

三、反应组分的选择及产品推荐

反转录(RT)反应

①模板

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

Takara拥有比较丰富的核酸产品线,提取的RNA纯度和完整性相对较高:

②引物

反转录引物的选择,应结合实验的具体情况,选择以下三种引物,即:Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA,上述三种引物都可以使用;一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。

对于基因特异性引物(GSP),推荐Takara公司提供的DNA/RNA合成服务,我们的优势如下:

③反转录酶

目前市面上常见的反转录酶主要有AMV和M-MLV两种,后者的使用率更高一些。此外,Takara公司在M-MLV来源的反转录酶基础上,特别研发了PrimeScript RTase系列,大大降低了反转录酶本身对于RNA的非特异结合,同时提高了反转录引物的特异性。通过这两个特点与本酶具有的强置换延伸活性,在对RNA损伤很小的42℃条件下,对于结构复杂的RNA及长链RNA也能够合成低背景的cDNA。

2021春季促销期间,如下两款反转录酶参与促销及满额赠礼等活动,感兴趣的老师不要错过!

聚合酶链式反应(PCR)

PCR反应部分,则以酶的选择最为重要。根据扩增性能及下游应用对保真性要求的不同,主要分为普通PCR酶和高保真酶两种类型。

根据客户的不同实验需求,Takara研发出了下表中的多种不同类型的RT-PCR试剂盒。普通PCR酶选择了扩增性能优越的Hot Start型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS,大大提高了试剂盒的扩增性能和反应特异性。高保真酶则选择了两款畅销的PrimeSTAR系列高保真酶,满足不同模板的高效率扩增需求。

2021春季促销期间,Takara有如下两款一步法RT-PCR试剂盒参与促销,感兴趣的老师不要错过哦!

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