酵母双杂交实验知多少?

Takara带您解密Matchmaker® Gold酵母双杂交系统!

【字体: 时间:2021年05月06日 来源:Takara

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  酵母双杂交实验的流程相对复杂,许多刚刚开展实验的老师很容易遇到各种各样的问题,不知道该如何应对。Takara将带您解密Matchmaker® Gold酵母双杂交系统,将收集汇总的酵母双杂交实验常见问题和应对方法分享给大家!

  

在蛋白质相互作用研究工作中,酵母双杂交技术往往是很多研究者的科研利器。然而酵母双杂交实验的流程相对复杂,许多刚刚开展实验的老师很容易遇到各种各样的问题,不知道该如何应对。Takara将带您解密Matchmaker® Gold酵母双杂交系统,将收集汇总的酵母双杂交实验常见问题和应对方法分享给大家!以此为您的实验保驾护航,再无后顾之忧!

Matchmaker® Gold酵母双杂交系统相关问题解答

问1:为什么要使用酵母表达系统来进行蛋白质互作研究?

答1:酵母可以提供一个体内真核系统,同时又兼具原核细菌系统的可操作性强、简单易用的优点。在酵母体内表达的蛋白质可以正确的折叠;提供中性pH内部环境;可以形成二硫键和其他真核系统共有的翻译后修饰。这些特点对于维持天然蛋白结构获得真实的蛋白质互作关系至关重要。同时,酵母可操作性强,并且已进行全基因组测序。利用同源重组可以很方便地直接在酵母中构建文库。

问2:用于酵母双杂交筛选的bait蛋白质有什么要求?

答2:Bait蛋白质应该是核蛋白质或胞浆蛋白质;分泌型蛋白质不能用作bait;通常来讲,bait不能带有跨膜结构域;bait和prey的互作不能依赖于糖基化,这是由于酵母翻译后修饰不包括糖基化;bait与GAL4 BD域融合表达后可以正确的折叠;bait不能激活酵母中转录报告基因的表达(即不能有自激活活性)。

问3:可以用于酵母双杂交实验的bait多大比较合适?

答3:以经验来看,bait不宜过大,过大的外源性融合蛋白在酵母中不稳定,我们推荐bait不超过100 kD,或bait载体的DNA插入片段不超过3 kb。大多数情况下,bait的设计依赖于经验,很难确定bait的效果会如何。酵母杂交中插入片段的N端与147个氨基酸的GAL4 BD融合表达,这可能会影响蛋白折叠,以及插入的结构域能否进行蛋白质互作。比较大的bait可能会引起非特异性互作而提高背景,推荐使用较小的、特异的bait进行酵母双杂交实验。小至8个氨基酸,大至750个氨基酸的蛋白都已经被成功用于酵母双杂交研究。

问4:什么是bait蛋白质自激活?为什么需要验证bait的自激活活性?该如何解决?

答4:如果bait是真核转录因子,有可能在不需要与prey互作的情况下就可以激活酵母报告基因的表达,这就是自激活。

可以通过检测bait菌株是否可以在含有AbA的选择性培养基上生长来进行验证。如果你的bait可以激活报告基因,你依然可以进行酵母双杂交,不过首先需要去除转录激活域。可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活。但是要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

问5:酵母文库可以反复冻融使用吗?

答5:一般来说,保存于25%甘油的酵母菌株在每次解冻后会丢失10%的活力细胞。因此,大多数冻存的酵母在融化温度不超过室温而且操作小心的条件下,最多可容忍10次冻融。有两个例外情况请注意:预制的酵母文库和酵母感受态细胞。为筛选到基因覆盖度最广的文库,预制的酵母文库一旦解冻,就必须立即使用且不要重新冻存。同样,为得到最高转化效率,酵母感受态细胞应该立即使用且避免冻存。

问6:使用Matchmaker系统做酵母双杂交,转化效率很低(没有做对照实验),这是什么原因?

答6:先建议做对照实验;DNA质量一定要高,可以用乙醇再次纯化;DMSO和Carrier DNA质量要高,最好是新鲜的,Carrier DNA在转化之前最好用沸水变性;SD培养基pH值应调为5.8,YPDA应调为6.5。重新配制培养基,检测对照的转化效率;可能是BD载体翻译出来的融合蛋白质对酵母菌有毒性。

酵母培养相关问题解答

问7:为什么酵母菌在培养基上培养有时会变成粉红色或红色?

答7:ADE2或ADE1菌株在低含量腺嘌呤培养基上生长时嘌呤前体积累造成菌株变红。
Takara的YPDA培养基采用优化后的培养基配方,可以在很大程度上避免色素的积累。

问8:固体培养基不凝固,是什么原因造成的?

答8:琼脂添加量正确的情况下,培养基不凝固可能是由于灭菌时间过长和pH值偏低造成的。部分地区的水质偏酸,这种情况下,建议调整SD基本培养基的pH值至5.8,YPDA培养基的pH值至6.5,在121℃的条件下,15 min高压灭菌。

问9:可以采用X-Gal而不是X-Alpha-Gal进行Matchmaker Gold系统蓝白斑筛选吗?

答9:不可以,X-Gal与X-Alpha-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(LacZ)的反应底物,而X- Alpha -Gal是酵母α-半乳糖苷酶(Mel1p)的反应底物。X-Alpha-Gal在Matchmaker Gold系统中用作蓝白筛选的筛选底物,在蛋白质互作激活mel1基因表达后,酵母细胞可以分泌表达Mel1p。

问10:做酵母 mating实验的最佳时间是多久?需要注意什么?

答10:酵母mating实验一般需要20-24小时。我们推荐通过检测到显微镜下的三叶草结构作为酵母接合反应成功的根据,一般的酵母接合效率为2-5%左右。

当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数,提高杂交效率。进行mating实验时,需要低速摇菌30-50 rpm条件下培养,20 h 后显微镜下观察是否有接合反应发生,若没有继续培养4 h。

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