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拿一段已知的序列,让SMARTer RACE拓宽它的边界!

【字体: 时间:2021年04月08日 来源:Takara

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  SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Template,模板末端的转换机制,在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成,后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。

分子克隆实验中常用的PCR技术通常是以已知基因序列为前提进行的,可是在实际研究中,经常会遇到未知的基因序列,研究人员便开发了反向PCR、RACE以及SSH等一系列的扩增未知序列的PCR技术。随着NGS技术的飞速发展,获得生物样品的全部转录本序列早已不再是奢求,然而受实验规模和经费的限制,有时候NGS并不是你想做就能做的。回顾现有的获取未知序列的技术,RACE无疑是一个经典的选择。

RACE是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写,即cDNA末端快速扩增技术,是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分区域已知序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法,也是快速扩增cDNA5’和3’末端的简单有效的方法。

RACE能解决什么问题?由于RACE技术能够获得全长cDNA,我们可以:

▪ 构建cDNA文库
▪ 对RNA的启动子、转录因子以及非编码区进行研究
▪ 获取已知片段旁侧序列,例如获得新发现的lncRNA的两端序列
▪ 利用RACE技术钓取基因家族候选新成员,为寻找同源基因提供新方法
▪ 鉴定预测基因是否真实准确以及对测序得到的某个序列再确认

【*在新冠疫情发现的初期,中国科学院武汉病毒研究所的研究人员就是使用Takara的SMARTer RACE 5′/3′试剂盒确认了2019-nCoV的5’末端序列,揭示了其在全基因组水平上与蝙蝠冠状病毒96%相同*1,已发表于《Nature》杂志。】

RACE如何操作?

传统的RACE方法应用“去帽法”原理:对Total RNA裸露的5‘磷酸基团进行去磷酸化,使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构,使用T4 RNA Ligase将5’RACE Adaptor连接到mRNA的5’端,反转录反应扩增cDNA,使用5’RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行PCR反应,扩增cDNA 5’末端的序列。

但传统的“去帽法”RACE有这样几个局限性:要求RNA起始量比较大,多个对RNA的处理、纯化步骤易导致RNA降解,实验步骤较多导致实验成功率较低等。

何以解忧?请看SMARTer RACE——突破传统方法的高效RACE!

SMARTer RACE方法能够解决传统方法的这些问题。SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Template,模板末端的转换机制,在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成,后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。

SMARTer RACE技术原理如下:

SMARTer技术的核心组分包括SMARTScribe反转录酶和SMARTer Oligo序列。 SMARTScribe反转录酶具有灵敏度高和延伸性能好的特点。根据我们的实验数据,SMARTScribe 反转录酶可以以低至10个拷贝的RNA为模板合成第一链cDNA;可获得长达14.6 kb的cDNA片段。

SMARTer RACE方法,除了引入了高灵敏度SMARTer cDNA合成技术,还引入了长、短两个PCR引物的设计来提高PCR特异性,并利用了Takara Bio Group专利的Suppression PCR技术,以降低PCR结果的背景,使RACE实验的成功率更高。

Suppression PCR降低PCR背景的原理如下图。当SMARTer Oligo这段序列与模板的某个位置形成错配后,在后续PCR过程中,这个错配得到的非特异性产物会形成一个锅柄状结构,不能与引物混合物中的短引物结合,也就不能作为模板被扩增,从而降低了PCR背景。

在PCR扩增了cDNA末端序列后,除了对PCR产物进行测序外,还需要将PCR产物克隆至载体后进行进一步的分析。SMARTer RACE试剂盒还引入了高效的In-Fusion无缝克隆技术,让克隆更高效,更简单。

综上所述,SMARTer RACE方法的优势非常明显:

▪ 高灵敏度,RNA起始量要求低,10 ng–1 μg total RNA或 poly A+ RNA均可
▪ 反转录酶和PCR酶的性能卓越,尤其针对于长片段和高GC含量基因
▪ 长短两个通用引物的设计,提高PCR扩增特异性
▪ 专利Suppression PCR技术,实现PCR低背景
▪ 专利In-Fusion无缝克隆技术,高效完成RACE片段的克隆

SMARTer RACE 5’/3’ Kit(Code No.634858/59)包含了RACE实验所需的全部核心试剂,一个试剂盒就是一个完整解决方案:

SMARTer RACE 5’/3’ Kit助力前沿应用


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【参考文献】
1. Zhou P, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 588(7836).

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