测序中的关键,PacBio专家分享样本制备的技巧与方法

【字体: 时间:2021年05月12日 来源:生物通

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  也许,您是在大学的生物课上学会了如何提取DNA。不过当您开展更多高风险的实验时,您可能会发现提取DNA进行测序可不仅仅是裂解、沉淀、洗涤、重悬那么简单。在此,PacBio的专家介绍了一些DNA提取的技巧和方法,可帮助您更轻松地分离DNA。

  

也许,您是在大学的生物课上学会了如何提取DNA。不过,当您开展更多高风险的实验时,您可能会发现提取DNA进行测序可不仅仅是裂解、沉淀、洗涤、重悬那么简单。在此,PacBio的专家介绍了一些DNA提取的技巧和方法,可帮助您更轻松地分离DNA。

为了获得最佳的结果来推动生物学发现,样本制备是测序项目中的关键步骤。在使用长读长测序技术时,包括HiFi测序,您不仅希望DNA没有缺口和降解,还希望得到长片段(几十kb)以实现梦寐以求的长读取。

瑞典乌普萨拉大学SciLifeLab的长读长测序专家Olga Pettersson建议,(样本制备的)目标是获得尽可能长、尽可能纯以及尽可能新鲜的分子。”

#1挑战:样本类型

无论是同一物种还是不同物种,高分子量DNA提取的难易程度以及提取后的稳定性都存在差异。例如,来自肝脏的DNA会因为肝脏中的酶而迅速降解,而从血液中提取出的DNA通常更稳定。一些植物的酚类和多糖会干扰提取,而软体动物的DNA酶活性很高,因此DNA保存变得很困难。

如果您在样本类型上有选择权,那么最好选择潜在污染物最少的细胞密集组织。对于脊椎动物,您可以选择血液、大脑、肾脏或肌肉等组织。某些无脊椎动物可能存在粘膜,抑制了获取高质量DNA的能力,因此您可能需要额外的DNA纯化步骤来去除污染物。

当研究小型节肢动物时,您可以使用成年个体。不过,与外壳坚硬的成虫相比,从蛹或幼虫中获取DNA可能更容易。在规划真菌测序项目时,考虑对样本进行培养,以便获得单个分离株。最后,对于植物来说,建议从黑暗处理(避光)24-72小时的单株植物中获取最幼嫩的叶/芽组织。

#2挑战:样本制备和保存

在确定使用哪种样本类型之后,高分子量DNA提取的第二个考虑因素是如何处理该样本。测序遵循的是“废进废出(garbage in, garbage out)”的原则,因此在制备样本时要谨慎。在大多数情况下,最新鲜的样本效果最好,其次是用液氮速冻并保存在-80°C的样本。这是因为组织一旦从活的生物体中取出,它就开始释放会降解DNA和RNA的因子,必须争分夺秒,才能保持遗传物质完整。

当然,我们无法每次都控制样本的制备或保存方式,在这种情况下,尽量尝试从样本中获得最好的DNA。有些用乙醇保存的样本可提供质量尚佳的DNA,也有一些博物馆标本可用于扩增子测序。

#3挑战:选择正确的方法

在测序项目中获取高分子量DNA的最后一个难题是提取方法。市场上不乏用于DNA提取的试剂盒、协议和教程,在花了数年时间寻找适合所有样本类型的最佳提取方法后,我们相信这种方法根本不存在!然而,有一些方法能够始终如一地产生大量的高分子量DNA。

一般来说,使用常见化学物质的“守旧派”方法效果很好。例如,酚和氯仿提取对许多组织都很有效,尽管这些化学物质的使用有些危险。CTAB法也是一种相当可靠的方法,能够从植物中获得良好的DNA。一旦您了解通过这些方法来制备DNA的原理,就可以调整方案来满足个别物种的需求。

如果您需要定制方案,可以查看PacBio的汇总资源Extract DNA for PacBio,这个页面收集了许多来自文献的DNA提取方案,按照物种进行分类。如果您需要一切全包的DNA提取试剂盒,可查看PacBio的DNA提取技术指南。如果您希望将这一步外包给第三方机构,也可以联系他们的认证服务供应商。

虽然可能没有一个万能的DNA提取解决方案,但PacBio相信,他们的经验及其客户的经验可以为您指明正确的方向,帮助您的HiFi测序项目取得成功。

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