MMI激光显微切割系统在肝脏疾病研究中的应用

德国MMI激光显微切割系统可直接切割目的位置的组织或细胞用于转录组研究，助力肝脏疾病相关研究。

德国MMI厂家的CellCut激光显微切割系统，可以直接切割目的位置的组织或单细胞，继而通过RNA-Seq（转录组测序）、WGS（全基因组测序）、微阵列芯片、qRT-PCR、MS（蛋白质谱）等方法，获得更加原始、更加真实的组学数据。CellCut激光显微切割技术具有较高的切割效率和高的收集成功率，并维持了较好的生物大分子活性，助力肝细胞再生机制、肝细胞移植刺激肝脏再生机制、丙型肝炎病毒慢性感染与清除、人类肝脏及其疾病中的芳香酶表达等的研究。

一、MMI CellCut激光显微切割系统助力肝细胞再生机制的研究

2020年Armanda Szucs等人发表的文章“Postnatal, ontogenic liver growth accomplished by biliary/oval cell proliferation and differentiation”研究了肝细胞的卵圆形细胞是否能够补偿因2-乙酰氨基芴（AAF）治疗而停滞的原癌性肝生长，且是否会受到已知可在若干反应中促进肝生长的胆酸（CA）的影响。在本研究中，作者将研究门静脉胆管/卵细胞（periportal biliary/oval cells (B/OC)）是否可以促进大鼠体内肝的生长。由于B / OC的增殖和分化是由组织学变化决定的，因此对肝脏的形态进行了彻底分析，然后进行了免疫组织化学分析、形态分析、增殖分析和基因表达研究。

其中，基因表达研究采用的是实时qRT-PCR的方法，该实验过程中样品的获取至关重要。本文中作者通过使用MMI CellCut激光显微切割系统从肝脏冰冻切片中切割B / OC和肝细胞（〜100.000μm2），然后进行总RNA的提取，反转为cDNA，最后通过qRT-PCR的方法完成了基因表达的研究。结果表明与对照组相比，每个实验组的两个细胞群中的TGR表达均被下调（图1A）。 然而，FXR被认为是转导胆汁酸的增殖信号，在AAF / CA大鼠的B / OC上被上调，而在肝细胞上的表达下降（图1B）。同样，实时qRT-PCR证实AAF处理后HGF和SCF表达显著增加（图1C）。 FXR表达的改变表明FXR可能有助于诱导干细胞驱动的再生。AAF处理的大鼠中HGF，IL-6和SCF表达增加，而TNFR1和IFNg的表达未检测到这种升高，表明HGF可能是驱动肝细胞和卵圆形细胞增殖的最有效的生长因子，IL-6和SCF也具有这种功能。最终表明，在本研究中的AAF / CA实验模型中，衰老相关生长因子产生和FXR在B / OC上调的结合可能是B / OC补偿性扩张的主要驱动力。

总之，本文作者描述了一种新的机制，即FXR在肝细胞和B / OC上的反向表达，当肝细胞受损时，它可能有助于激活肝干细胞。 当产后生理生长过程中肝细胞增殖受阻，导致干细胞增殖/分化介导的肝细胞生长时，就会激活该机制。

图1. 胆汁酸受体和衰老相关蛋白的相对mRNA水平。 A.B. 在实验的第10天，对显微解剖的肝细胞（H）和胆/卵细胞（B / OC）中的TGR5（A）和FXR（B）mRNA表达进行qRT-PCR分析。C.在实验的第10天，对全肝样品中IL-6，SCF和HGF mRNA表达的qRT-PCR分析。

二、MMI CellCut激光显微切割系统助力Thy11细胞移植刺激肝脏再生机制研究

2016年Norihisa Ichinohe等人发表的文章“Transplantation of Thy11 Cells Accelerates Liver Regeneration by Enhancing the Growth of Small Hepatocyte-Like Progenitor Cells via IL17RB Signaling”对Thy11细胞的移植可加速肝脏再生的机制进行了研究。小肝样细胞祖细胞（SHPC）在逆转录（Ret）/ 70％部分肝切除术（PH）处理的大鼠肝脏中短暂形成簇。作者将经D-半乳糖胺处理的大鼠肝脏中分离的Thy11细胞移植到Ret / PH处理的大鼠的肝脏中时，受体肝的质量在移植后的前30天短暂增加，这表明肝脏的再生得到了增强。在这里，作者讨论了Thy11细胞移植如何刺激肝脏再生。作者发现，移植后第14天，肝脏中SHPC簇的数量和大小增加。基因芯片分析表明，在移植了Thy11细胞的肝脏的SHPC中，白细胞介素17受体b（IL17rb）的表达显著增加。作者随后搜索表达配体的细胞，发现正弦内皮细胞（SEC）和库普弗细胞（Kupffer）分别表达Il17b和Il25。从Thy11细胞培养的条件培养基中分离的细胞外囊泡（EV）分别在SEC和Kupffer细胞中诱导IL17b和IL25表达。此外，EV增强了小肝细胞（SHs）中IL17rb的表达，SHs是肝细胞的祖细胞。在培养中，IL17B刺激了SH的生长。这些结果表明，Thy1-EVs通过靶向SEC，Kupffer细胞和SHPC来协调IL17RB信号传导，从而增强肝脏再生。实际上，在Ret / PH处理的大鼠肝脏中，Thy1-EVs的使用增加了SHPC簇的数量和大小。移植后60天，大多数扩张的SHPC进入细胞衰老，肝脏扩张恢复到正常大小。总之，Thy11细胞移植通过IL17RB信号传导促进内在肝祖细胞的增殖，从而增强了肝脏的再生能力。

在本项研究中，关于基因芯片分析的样本获取，作者采用了MMI激光显微切割系统对7mm厚的肝脏组织冷冻切片进行了切割，获取了SHPC细胞群来提取总RNA进行基因芯片分析捕获细胞的基因表达情况（图2）。

图2. Thy11细胞移植后SHPC的基因表达。图像反映了接受Thy11细胞移植的肝脏在激光显微切割之前（A-1）和之后（A-2）去核SHPC的代表性图像。 A-1中的虚线圈选了SHPC群集。（B）表示代表性的生长因子和细胞因子的受体选择的基因的热图。相对基因表达以log2标度显示。mRNA表达的增加表示为红色阴影，而减少表示为蓝色阴影。（C）通过实时定量PCR证实了接受Thy11细胞移植的肝脏的SHPC和没有SHPC的肝细胞中IL17rb的表达。星号表示统计学上的显著差异， p ＜0.05。

三、MMI CellCut激光显微切割系统助力丙型肝炎病毒慢性感染与清除的研究

2014年Timothy Sheahan等人发表的文章“Interferon Lambda Alleles Predict Innate Antiviral Immune Responses and Hepatitis C Virus Permissiveness”对干扰素lambda（IFNL）基因座的遗传变异与丙型肝炎病毒（HCV）慢性感染和清除的机制进行了研究。HCV感染可导致病毒慢性感染或清除。尽管宿主遗传学，特别是IFNL基因座的遗传变异与HCV的自发清除和治疗成功有关，但指导这些临床结果的机制仍不清楚。因此，作者利用MMI接近单细胞分辨率的激光捕获显微切割驱动的无偏系统病毒学方法，分离并转录定位了HCV感染和邻近的原代人肝细胞（PHHs）（图3）。先天性抗病毒免疫信号主导了转录反应，但HCV感染细胞和邻近细胞之间在数量和多样性上存在差异。通过比较感染频率高和低的供体，确定与更有效的抗病毒控制相关的分子特征。来自临床上不适宜IFNL基因型的供体的细胞被感染的频率更高，并且表现出抑制的抗病毒和细胞死亡反应。这些数据表明，早期病毒与宿主的相互作用，特别是宿主遗传和先天免疫的诱导，决定了HCV感染的结果。

图3. LCM分离HCV感染的PHHs。A.HCV依赖荧光再定位（HDFR）报告者。HCV感染的表达HDFR的PHH的相位差（左）和荧光（右）图像。填充箭头，HDFR核易位HCV感染细胞。空箭头，HDFR未转移到相邻单元格。B.激光捕获显微切割（LCM）示意图。收集表面对载玻片膜有粘性，便于切割时捕获。C.模拟细胞、HCV感染细胞和邻近细胞的捕获示意图。D.从LCM到阵列的工作流示意图。E.从左到右逐步记录模拟细胞、HCV感染细胞和邻近细胞的LCM。F.LCM样品裂解液中HCV基因组的定量RT-PCR检测。每个点代表每10个单元格的平均值。每个时间点（感染后天数，dpi）的供体数量（供体n）显示在灰色框中。星号表示ANOVA确定的统计显著性（p<0.001）。

四、MMI CellCut激光显微切割系统助力人类肝脏及其疾病中的芳香酶的研究

2013年Shuko Hata等人发表的文章“Aromatase in human liver and its diseases”对人类肝脏及其疾病中的芳香酶的表达细节进行了研究。与正常肝相比，肝炎和肝细胞癌（HCC）中已有芳香酶过表达的报道，但在这些肝病中的细节仍不清楚。因此，在这项研究中，作者首先使用免疫组织化学技术对肝硬化，脂肪肝，肝炎，HCC和转移性肝癌（MLC）患者进行免疫定位芳香化酶，以研究肝内芳香化酶的详细机制。主要在肿瘤细胞周围的非肿瘤性肝细胞中检测到芳香酶的免疫反应性。然后，作者通过共培养系统使用HepG2作为肝细胞的替代模型，评估了肝细胞与癌细胞之间的相互作用对芳香化酶mRNA表达的影响。 通过与所有检查的癌细胞系共培养，HepG2中的芳香酶mRNA水平显著增加。作者还评估了芳香化酶外显子1的可变剪接，但是在HepG2细胞中使用了相同的剪接变体，而与共培养系统中使用的癌细胞系无关。在HepG2中获得的这些发现表明，无论是转移性还是原发性的癌细胞中，可能通过人类肝微环境中的可溶性芳香化酶诱导因子在邻近的正常肝细胞中诱导了芳香化酶表达。

在该研究中，细胞间的“直接”接触对于体外检测免疫和神经功能非常重要。然而，白蛋白和尿素在“直接”和“分离”共培养的成年和胎鼠肝细胞之间没有显著差异。因此，在本研究中，作者还采用“接触”共培养系统检测了直接接触癌细胞对HepG2细胞芳香化酶表达的影响。这是首次利用MMI激光显微切割系统和随后的qRT-PCR分析，证明芳香化酶mRNA在癌细胞系共培养/LCM的“接触”中的表达（图4）。在本分析中，位于接触区的HepG2与癌细胞系和HepG2细胞之间未检测到物理接触的远处区域的HepG2之间没有显著差异。这些来自“分离”和“接触”共培养分析的结果证明，癌细胞系在HepG2细胞中诱导芳香化酶主要取决于癌细胞分泌的可溶性因子，而不是直接的物理“细胞间接触”。

图4. 芳香化酶在共培养/LCM-HepG2中的表达。（A） 共培养/LCM模型系统。（B）在膜上共培养的HepG2中用于芳香化酶的LCM/qPCR结果，通过甲苯胺蓝染色观察共培养。a.切割HepG2和DLD-1边界区域前；b.切割HepG2和DLD-1边界区域后；c.切割HepG2和MCF-7边界区域前；d.切割HepG2和MCF-7边界区域后。H， HepG2区；D，DLD-1区；M，MCF-7区。（C） 共培养HepG2中芳香化酶表达的LCM/qPCR结果。（a）与DLD-1共培养；（b）与MCF-7共培养。H，仅HepG2区域；C，仅癌细胞系区域；B，HepG2边界区域。

参考文献
[1] Armanda Szücs, Sándor Paku, Endre Sebestyén, et al. Postnatal, ontogenic liver growth accomplished by biliary/oval cell proliferation and differentiation[J]. PLoS ONE, 2020, 15(5):e0233736.
[2] Ichinohe N, Ishii M, Tanimizu N, et al. Transplantation of Thy1+ Cells Accelerates Liver Regeneration by Enhancing the Growth of Small Hepatocyte‐Like Progenitor Cells via IL17RB Signaling[J]. Stem Cells, 2016, 35(4):920-931.
[3] Sheahan T, Imanaka N, Marukian S, et al. Interferon Lambda Alleles Predict Innate Antiviral Immune Responses and Hepatitis C Virus Permissiveness[J]. Cell host & microbe, 2014, 15(2):190-202.
[4] Hata S, Miki Y, Saito R, et al. Aromatase in human liver and its diseases[J]. Cancer Medicine, 2013, 2(3):305-315.

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞分选系统成为目前世界上性能优异的样本处理系统。基因有限公司作为MMI产品中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等。

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