基因编辑实验壁垒多？不妨试试Cas9 RNP体系

近年发展起来的Cas9 RNP体系由于快捷安全、可避免质粒整合的问题、并减少脱靶效应，可适用于各种模式生物和细胞类型，如难转染的干细胞、免疫细胞、原代细胞等，引起了科学家们的广泛关注。

CRISPR-Cas9是一种在gRNA或crRNA+tracrRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组定点编辑的技术，Cas9和gRNA或crRNA+tracrRNA可通过多种方式导入细胞，其在胞内的高效表达直接影响CRISPR-Cas9系统的编辑效率。通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。然而，这容易导致外源基因片段的不可控插入，并引起免疫反应，存在潜在的威胁，这在一定程度上限制了CRISPR-Cas9技术在机体的应用[1]。

近年发展起来的Cas9 RNP体系由于快捷安全、可避免质粒整合的问题、并减少脱靶效应，可适用于各种模式生物和细胞类型，如难转染的干细胞[2]、免疫细胞[3]、原代细胞[4]等，引起了科学家们的广泛关注。简单来说，RNP体系只需将Cas9蛋白和体外转录的gRNA或直接化学合成的crRNA+tracrRNA进行孵育，二者通过静电相互作用以及结构嵌合性，在体外组装形成RNP复合物，然后通过转导方式将其导入待编辑细胞即可实现非同源性末端重组（NHEJ），在供体DNA存在的条件下还可以实现特定基因的修复和插入[1]。

图1. Cas9 RNP的组装及其作用机制（以gRNA为例）[1]

Cas9 RNP体系编辑效率的优势：

• 与mRNA转染类似，RNP方式避免了外源基因插入的风险[5]，不容易引起机体的免疫反应，但相比mRNA，不但Cas9蛋白更加稳定，而且形成的RNP复合物可以提高gRNA或crRNA+ tracrRNA的稳定性[6]，有利于推动CRISPR-Cas9技术在临床以及动植物改造中的应用；
• 不同于质粒转染或病毒感染方式，会导致Cas9蛋白在细胞内持续表达。RNP复合物转导入细胞后，Cas9蛋白在一定时间内即会降解，在一定程度上可以降低脱靶效应[7]；
• 操作简便快捷，在体外将Cas9蛋白和gRNA或crRNA+tracrRNA混合，转导后即可进行基因编辑，并且由于不需要转录、翻译的过程，RNP体系可以实现即时快速的基因编辑。

表1. CRISPR-Cas9不同形式下基因编辑的比较[1]

项目	质粒/病毒	全RNA体系	RNP体系	参考文献
编辑效率	++	++	+++	[8]
插入突变	+++	-	-	[9]
免疫性	+++	++	+	[5]
脱靶率	+++	++	+	[7]
组分胞内表达时间	＞12h	＞2h	-	[7]
组分稳定性	+++	+	++	[6,10]

riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP体系：

锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白复合物）由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成，其中tracrRNA可实现大规模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，Cas9蛋白为热稳定S.pyogenes来源的核酸酶（又称为spCas9），仅需将crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞，即可快速实现靶基因的编辑。与传统Cas9/gRNA质粒转染相比，基因编辑效率更高，脱靶效应更低，且无DNA整合的风险，是更加理想的基因编辑系统。

图2. 锐博生物RNP体系工作示意图

RNP体系特点：

• 自主专利技术，优化的gRNA（crRNA与tracrRNA）和Cas9 mRNA
• 瞬时表达，有效降低脱靶率
• 无DNA组分，不整合任何病毒或质粒基因
• 编辑效率更高，适用于哺乳动物细胞
• 毒性更低，激活先天免疫反应更小，减少细胞死亡
• 即用型（Ready-to-Use），更加易用，适合从小规模实验到大规模高通量筛选
• 兼容多种导入模式：化学转染（mRNA转染）、电转或电穿孔、显微注射等

crRNA设计合成：靶向目的DNA序列

riboEDIT Designed crRNA采用优化的生物信息学设计，包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸（原间隔序列）和与tracrRNA互补配对的重复序列，涵盖人类和小鼠基因（其他物种需评估），每个基因设计合成3-6段单独的sgRNA，经过严格的PAGE纯化。

通用型tracrRNA：与crRNA形成gRNA

riboEDIT tracrRNA采用化学合成通用型tracrRNA，经PAGE纯化，能够抗核酸酶，能与crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物，共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA与riboEDIT crRNA是专利配套体系，两者必须配套使用（不兼容其他体系的crRNA）。

Cas9 mRNA：瞬时表达Cas9蛋白

riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP体系的重要组成部分，可与crRNA和tracrRNA形成RNP复合物，从而对目的DNA序列进行剪切。该即用型的RNP体系适合化学转染（借助蛋白转染试剂）、显微注射或电转（电穿孔）进行基因编辑。500pmol的Cas9蛋白相当于83ug，一般情况下每孔转染1-2ug的Cas9蛋白，可转染超过40次以上。

图3. riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因组剪切效率

MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein，48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率，候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示，#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

T7E1 Enzyme酶：检测编辑效率

riboEDIT T7EI Enzymes是经E.coli重组表达的结构特异性酶，可识别并切割非完全配对的双链DNA、十字形结构DNA、 Holliday交叉DNA、异源双链DNA，或缓慢地切割带有切刻的双链DNA；可有效识别大于1个碱基的基因错配，广泛应用于由CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介导的基因突变检测。

图4. 检测T7EI酶切后的DNA片段

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产品编号	产品名称	目录价
CR-NRA-1	riboEDIT Designed crRNA（设计合成crRNA）	询价
crT00001-5	riboEDIT tracrRNA, 5nmol	¥628.00
C11053-1	riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol	¥1,260.00
C11054-1	riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul)，100U	¥880.00
crRP0001VS	riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (验证用阳性对照crRNA及正反引物)	¥1,000.00

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参考文献：

[1] PAN H, YANG H, YU S, et al. Progress in Gene Editing Methods of CRISPR/Cas9 Based on in Vitro Assembly of Ribonucleoprotein[J]. China Biotechnology, 2019, 39(1): 71-76.
[2] Wang R, Graham S, Gao L, et al. Editing the immune system in vivo in mice using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP)-mediated gene editing of transplanted hematopoietic stem cells[J]. Methods, 2021.
[3] Schumann K, Lin S, Boyer E, et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(33): 10437-10442.
[4]徐娅, 付烊, 朱诗聪,等. 利用Cas9 RNP技术制备B2M和PD-1高效率双基因敲除的人原代T淋巴细胞[J]. 肿瘤防治研究, 2020(6):403-410.
[5] Chen X, Gonçalves M A F V. Engineered viruses as genome editing devices[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3): 447-457.
[6] Jinek M, Jiang F, Taylor D W, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J]. Science, 2014, 343(6176).
[7] Burger A, Lindsay H, Felker A, et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Development, 2016, 143(11): 2025-2037.
[8] Wang H X, Li M, Lee C M, et al. CRISPR/Cas9-based genome editing for disease modeling and therapy: challenges and opportunities for nonviral delivery[J]. Chemical reviews, 2017, 117(15): 9874-9906.
[9] Woo J W, Kim J, Kwon S I, et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(11): 1162-1164.
[10] Kim S, Kim D, Cho S W, et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins[J]. Genome research, 2014, 24(6): 1012-1019.