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基因编辑实验壁垒多?不妨试试Cas9 RNP体系

【字体: 时间:2021年05月25日 来源:锐博生物

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  近年发展起来的Cas9 RNP体系由于快捷安全、可避免质粒整合的问题、并减少脱靶效应,可适用于各种模式生物和细胞类型,如难转染的干细胞、免疫细胞、原代细胞等,引起了科学家们的广泛关注。

CRISPR-Cas9是一种在gRNA或crRNA+tracrRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组定点编辑的技术,Cas9和gRNA或crRNA+tracrRNA可通过多种方式导入细胞,其在胞内的高效表达直接影响CRISPR-Cas9系统的编辑效率。通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。然而,这容易导致外源基因片段的不可控插入,并引起免疫反应,存在潜在的威胁,这在一定程度上限制了CRISPR-Cas9技术在机体的应用[1]。

近年发展起来的Cas9 RNP体系由于快捷安全、可避免质粒整合的问题、并减少脱靶效应,可适用于各种模式生物和细胞类型,如难转染的干细胞[2]、免疫细胞[3]、原代细胞[4]等,引起了科学家们的广泛关注。简单来说,RNP体系只需将Cas9蛋白和体外转录的gRNA或直接化学合成的crRNA+tracrRNA进行孵育,二者通过静电相互作用以及结构嵌合性,在体外组装形成RNP复合物,然后通过转导方式将其导入待编辑细胞即可实现非同源性末端重组(NHEJ),在供体DNA存在的条件下还可以实现特定基因的修复和插入[1]。


图1. Cas9 RNP的组装及其作用机制(以gRNA为例)[1]

Cas9 RNP体系编辑效率的优势:

• 与mRNA转染类似,RNP方式避免了外源基因插入的风险[5],不容易引起机体的免疫反应,但相比mRNA,不但Cas9蛋白更加稳定,而且形成的RNP复合物可以提高gRNA或crRNA+ tracrRNA的稳定性[6],有利于推动CRISPR-Cas9技术在临床以及动植物改造中的应用;
• 不同于质粒转染或病毒感染方式,会导致Cas9蛋白在细胞内持续表达。RNP复合物转导入细胞后,Cas9蛋白在一定时间内即会降解,在一定程度上可以降低脱靶效应[7];
• 操作简便快捷,在体外将Cas9蛋白和gRNA或crRNA+tracrRNA混合,转导后即可进行基因编辑,并且由于不需要转录、翻译的过程,RNP体系可以实现即时快速的基因编辑。

表1. CRISPR-Cas9不同形式下基因编辑的比较[1]

项目

质粒/病毒

RNA体系

RNP体系

参考文献

编辑效率

++

++

+++

[8]

插入突变

+++

-

-

[9]

免疫性

+++

++

+

[5]

脱靶率

+++

++

+

[7]

组分胞内表达时间

12h

2h

-

[7]

组分稳定性

+++

+

++

[6,10]

riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP体系:

锐博生物riboEDIT™ CRISPR-Cas9 RNP(核糖核蛋白复合物)由化学合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白组成,其中tracrRNA可实现大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,Cas9蛋白为热稳定S.pyogenes来源的核酸酶(又称为spCas9),仅需将crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合后转染细胞,即可快速实现靶基因的编辑。与传统Cas9/gRNA质粒转染相比,基因编辑效率更高,脱靶效应更低,且无DNA整合的风险,是更加理想的基因编辑系统。


图2. 锐博生物RNP体系工作示意图

RNP体系特点:

• 自主专利技术,优化的gRNA(crRNA与tracrRNA)和Cas9 mRNA
• 瞬时表达,有效降低脱靶率
• 无DNA组分,不整合任何病毒或质粒基因
• 编辑效率更高,适用于哺乳动物细胞
• 毒性更低,激活先天免疫反应更小,减少细胞死亡
• 即用型(Ready-to-Use),更加易用,适合从小规模实验到大规模高通量筛选
• 兼容多种导入模式:化学转染(mRNA转染)、电转或电穿孔、显微注射等

crRNA设计合成:靶向目的DNA序列

riboEDIT Designed crRNA采用优化的生物信息学设计,包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸(原间隔序列)和与tracrRNA互补配对的重复序列,涵盖人类和小鼠基因(其他物种需评估),每个基因设计合成3-6段单独的sgRNA,经过严格的PAGE纯化。

通用型tracrRNA:与crRNA形成gRNA

riboEDIT tracrRNA采用化学合成通用型tracrRNA,经PAGE纯化,能够抗核酸酶,能与crRNA结合形成crRNA/tracrRNA复合物,共同指导Cas9蛋白切割双链DNA。需要注意的是,riboEDIT tracrRNA与riboEDIT crRNA是专利配套体系,两者必须配套使用(不兼容其他体系的crRNA)。

Cas9 mRNA:瞬时表达Cas9蛋白

riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP体系的重要组成部分,可与crRNA和tracrRNA形成RNP复合物,从而对目的DNA序列进行剪切。该即用型的RNP体系适合化学转染(借助蛋白转染试剂)、显微注射或电转(电穿孔)进行基因编辑。500pmol的Cas9蛋白相当于83ug,一般情况下每孔转染1-2ug的Cas9蛋白,可转染超过40次以上。


图3. riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因组剪切效率

MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。

T7E1 Enzyme酶:检测编辑效率

riboEDIT T7EI Enzymes是经E.coli重组表达的结构特异性酶,可识别并切割非完全配对的双链DNA、十字形结构DNA、 Holliday交叉DNA、异源双链DNA,或缓慢地切割带有切刻的双链DNA;可有效识别大于1个碱基的基因错配,广泛应用于由CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介导的基因突变检测。


图4. 检测T7EI酶切后的DNA片段

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CR-NRA-1

riboEDIT Designed crRNA(设计合成crRNA

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crT00001-5

riboEDIT tracrRNA, 5nmol

¥628.00

C11053-1

riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol

¥1,260.00

C11054-1

riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul)100U

¥880.00

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riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (验证用阳性对照crRNA及正反引物)

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参考文献:

[1] PAN H, YANG H, YU S, et al. Progress in Gene Editing Methods of CRISPR/Cas9 Based on in Vitro Assembly of Ribonucleoprotein[J]. China Biotechnology, 2019, 39(1): 71-76.
[2] Wang R, Graham S, Gao L, et al. Editing the immune system in vivo in mice using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP)-mediated gene editing of transplanted hematopoietic stem cells[J]. Methods, 2021.
[3] Schumann K, Lin S, Boyer E, et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(33): 10437-10442.
[4]徐娅, 付烊, 朱诗聪,等. 利用Cas9 RNP技术制备B2M和PD-1高效率双基因敲除的人原代T淋巴细胞[J]. 肿瘤防治研究, 2020(6):403-410.
[5] Chen X, Gonçalves M A F V. Engineered viruses as genome editing devices[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3): 447-457.
[6] Jinek M, Jiang F, Taylor D W, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J]. Science, 2014, 343(6176).
[7] Burger A, Lindsay H, Felker A, et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Development, 2016, 143(11): 2025-2037.
[8] Wang H X, Li M, Lee C M, et al. CRISPR/Cas9-based genome editing for disease modeling and therapy: challenges and opportunities for nonviral delivery[J]. Chemical reviews, 2017, 117(15): 9874-9906.
[9] Woo J W, Kim J, Kwon S I, et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(11): 1162-1164.
[10] Kim S, Kim D, Cho S W, et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins[J]. Genome research, 2014, 24(6): 1012-1019.

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