单细胞蛋白质组学:从小样本中获得大见解

【字体: 时间:2021年09月03日 来源:生物通

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  以往,大量细胞分析提供了蛋白质、基因或代谢物的平均值。如今,单细胞分析正在揭示组织内各个细胞之间的差异。

以往,大量细胞分析提供了蛋白质、基因或代谢物的平均值。如今,单细胞分析正在揭示组织内各个细胞之间的差异。这些信息将有助于人们从细胞和分子层面上了解因果关系,也有助于解释复杂的疾病状态是如何产生并持续存在的。

赛默飞世尔科技的质谱专家Daniel Lopez-Ferrer博士称:“我们的目标是从特定研究中获得最大的数据粒度,从而让我们更好地解释生物学。”例如,对多种细胞组成的肿瘤微环境进行研究,以便实现早期肿瘤检测并破译药物靶点。

大量细胞分析无法了解不同的细胞类型及其功能,它只能提供一个读数,代表细胞的平均反应。这种平均值,不仅包括感兴趣的特征(比如细胞表面标志物或其他表型),还包括实验假象和错误,因此混淆了特定细胞对这些事件的贡献。

对蛋白质组学而言,单细胞分析的局限性在于样本太小(单个细胞)以及它们所含的蛋白质数量极少。“获取细胞不是问题,”Lopez-Ferrer说。“问题在于,为了达到统计能力,您必须分析数百个或数千个细胞。每次LC/MC分析大约需要一小时,那么一项简单的研究可能就需要十天左右,前提是一切都按计划进行。”

此外,人类细胞会产生8万到40万种不同的蛋白质。并非所有蛋白都同时表达,有些是某个基本分子的不同亚型(isoform)。“大海捞针”的比喻也许是恰当的。单细胞蛋白质组学方法每天最多能分析300个细胞,对每个细胞中的2500个蛋白进行定量分析。

单细胞工作流程

单细胞流程当然也是从样本处理开始。对样本进行处理,使细胞分开和悬浮,然后通过荧光活化细胞分选(FACS)进行分离。单个细胞被分配到微量滴定板的各个孔中或芯片型分析系统上,在那里进行裂解。干扰质谱分析的裂解剂需要除去,但由于纯化会导致样本损失,因此研究人员尽量避免使用。

业内人士、单细胞分选公司Namocell的营销总监Matt Salem表示,FACS是细胞分选的首选方法,但也存在缺点。损失率高(有时非常高),需要训练有素的操作人员,而且购买和操作成本都很高。

当然,损失并不仅仅发生在细胞分选阶段。Salem补充说,“粘稠的蛋白质很难通过液相色谱(LC)分离,因此这个步骤也会造成损失。这将会进一步造成灵敏度问题或分析偏倚。有时,您只是无法从单个细胞的蛋白质中产生足够的离子。”

为了解决这些灵敏度问题,一些操作方案将未标记的载体蛋白添加到混合物中,以缓解小样本量带来的损失。虽然这些方法有点用,但仍需要质谱技术的进步,特别是在电离效率方面的进步,才能处理小的样本量和体积。

Lopez-Ferrer认为:“如果没有自动化液体处理系统,这些工作流程将无法实现,自动化系统带来了准确的纳升级流体操作,以及一致性和稳定性。”

早期对单细胞蛋白质组学的尝试使用了基质辅助激光解吸电离(MALDI),这是一种软电离技术,可以保留不稳定的分子特征,并最大限度减少样本损失和样本制备步骤。

基于MALDI的方法是在上世纪90年代首次使用的。人们采用MALDI作为离子源,并用飞行时间(TOF)作为质量分析器,从而提供一种功能性的单细胞分析。不过,这些技术存在三个主要缺点:MALDI不能在时域内分离肽段,无法对大量蛋白质进行测序,而且MALDI电离的可变性会影响定量的准确性。

另一种电离蛋白质的方法,电喷雾电离(ESI),则更容易实现测序,因为它很容易与各种分离方法(如毛细管电泳)相结合。然而,ESI需要大量的样本制备,这可能导致损失,让人们无法接受。

新方法层出不穷

2018年,美国东北大学的Nikolai Slavov教授开发出一种名为SCoPE-MS的单细胞蛋白质组学质谱分析方法。它采用纳米液相色谱或电泳作为前端的分离方法。在分离步骤前添加标记的载体蛋白,以减少因与纳米液相色谱柱相互作用而造成的损失。首次质谱扫描提供了蛋白身份,接下来,感兴趣的蛋白质会进行碎片化和进一步的质谱分析。通常只有高丰度的峰可用于测序,但SCoPE-MS通过汇集多个细胞的相同标记蛋白克服了这一限制。

同年,美国太平洋西北国家实验室的科学家也开发出一种更高效的单细胞蛋白质组学方法,将其命名为nanoPOTS(Nanodroplet processing in one pot for trace samples)。它能够将处理量降低到200 nL以下,从而提高样本处理的效率和回收率。在与超灵敏LC/MS结合使用时,nanoPOTS能够从低至10个细胞中鉴定出1500至3000种蛋白质。在原始论文中,他们定量了单个胰岛中大约2400种蛋白质。

应对未来的挑战

单细胞蛋白质组学也许更适合勇敢的人。这项技术还需要很多工作,才能满足成本、灵敏度、稳定性和可靠性等方面的需求,应用于日常科研、生物制造和诊断。

“不过在此之前,人们必须解决单细胞分离的挑战,以及验证质谱技术和流程的挑战。此外,临床背景下的技术人员还需要更多的全面整合流程。目前运行16个样本大约需要两到三个小时,这也需要改进。”

Lopez-Ferrer表示,他目前还没有看到这些方法直接应用在生物制造中,不过单细胞分析可以在生产单克隆抗体时协助克隆选择。他认为,未来肯定会实现这一点,因为生物制药公司对这些方法很感兴趣。

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