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2022年1月10日，清华大学药学院谭旭课题组在《Nature Communications》上在线发表了题为“Gain-of-function genetic screening identifies the antiviral function of TMEM120A via STING activation”的研究论文，该研究应用人类全基因组过表达系统，筛选出了新的寨卡病毒的抑制因子TMEM120A，并进一步发现其可以促进STING从ER到ERGIC的转运，从而增强抗病毒先天免疫
2022年1月10日，清华大学药学院谭旭课题组在《Nature Communications》上在线发表了题为“Gain-of-function genetic screening identifies the antiviral function of TMEM120A via STING activation”的研究论文，该研究应用人类全基因组过表达系统，筛选出了新的寨卡病毒的抑制因子TMEM120A，并进一步发现其可以促进STING从ER到ERGIC的转运，从而增强抗病毒先天免疫。
研究背景 早在1947年，人类就从寨卡森林的猴子身上发现并分离出了寨卡病毒（Zika virus）【1】。过去几十年，由于仅在非洲和东南亚呈零星散在性爆发，且感染者仅表现出发热，头疼等较轻症状，并没有引起的足够的重视【2】。自2015年巴西的最近一次爆发，越来越多的证据表明：寨卡病毒感染会导致新生儿小头畸形等神经发育缺陷性疾病 【3, 4】。但是，由于先前的研究不足，到目前为止仍缺乏能有效地对抗寨卡病毒感染的疫苗和治疗策略。
寨卡病毒入侵宿主细胞的过程中，会劫持和降解特定的宿主蛋白，以促进自身的复制；同时，宿主细胞识别病毒的入侵，激活I型干扰素通路等途径，动员抗病毒蛋白以阻止病毒的入侵。全面了解寨卡病毒与宿主蛋白的相互作用，有助于开发新型的治疗方法。2015年以来，多个研究团队运用功能丧失型筛选方法，如CRISPR-Cas9，RNAi 【5-7】，筛选出了多种寨卡病毒相关宿主因子，使我们对寨卡病毒与宿主蛋白的相互作用有了更为清晰的认识。
但是，如果使用的细胞系内不表达特定的蛋白，功能丧失型筛选方法就无法筛选出该蛋白，另外，病毒会利用多种宿主蛋白来完成其复制周期中的同一过程，细胞也会动员多种宿主因子对抗病毒的复制周期的同一环节，因此，功能丧失型筛选无法筛选出所有的病毒相关因子。 寨卡病毒抑制因子TMEM120A的发现 考虑到CRISPR-Cas9，RNAi等功能丧失型筛选方法的缺陷，在本研究中，为鉴定新的寨卡病毒宿主因子，作者应用全基因组慢病毒过表达筛选系统，在肝癌细胞系Huh7细胞中进行了功能获得型筛选。该慢病毒过表达系统涵盖了编码人类蛋白的超过16000个开放阅读框（ORF），每个ORF都被一小段特定的随机序列（条形码）所编码。筛选的流程见图1.a。作者将包含ORF的慢病毒质粒转入HEK293T细胞中包被ORF慢病毒文库；慢病毒ORF文库转导Huh7细胞后，用嘌呤霉素筛选转导成功的细胞；用寨卡病毒感染转导成功的Huh7细胞10天，然后，提取存活的Huh7细胞（<5%）基因组DNA，扩增ORF对应的条形码进行高通量测序。对测序数据进行生物信息学分析后，发现已知的抗病毒蛋白IL-27和I型干扰素IFNA2，IFNA4，IFNA6，IFNA7都被明显富集，通过验证明显富集，但抗病毒功能未知的候选蛋白，作者发现TMEM120A（又名TACAN，NET29，TMPIT等）可以显著地抑制寨卡病毒的感染（图1.b）。另外，作者发现TMEM120A在U87MG（人脑星形胶质母细胞瘤）细胞中也可以显著地抑制寨卡病毒感染（图1.c，d），由于寨卡病毒对神经发育影响较大，这一结果预示着TMEM120A（大量表达或功能激活）或可以在胎儿发育早期干预寨卡病毒感染，预防小头症。
图1. 人类全基因组过表达筛选系统鉴定出TMEM120A可以抑制寨卡病毒感染; a. 全基因组过表达筛选系统流程图；b. 筛选所得候选基因的散点图；c, d. TMEM120A过表达可以抑制寨卡病毒感染U87MG细胞（c. 寨卡病毒 NS5 RNA水平；d. 寨卡病毒 NS1蛋白水平）
TMEM120A与2021年诺贝尔生理学或医学奖 2021年的诺贝尔生理学或医学奖被授予了David Julius和Ardem Patapoutian两位科学家，表彰他们在“发现温度和触觉受体”方面取得的突破性成就。其中，Ardem Patapoutian教授发现了可以感受机械刺激的离子通道PIEZOs（PIEZO1和PIEZO2）。有趣的是，2020年Beaulieu-Laroche, Lou等在Cell杂志报道了TMEM120A是一种全新的机械刺激感受型离子通道（图2a）【8】，有可能是继PIEZOs之后，迄今为止发现的第二类机械刺激感受型离子通道。但是，2021年陆续有来自中国（分别来自中科院生物物理所的柳振峰团队和西湖大学的吴建平团队）和美国（分别来自洛克菲勒大学的MacKinnon组和德州西南医学中心的Youxin Jiang组）4篇论文解析了TMEM120A的结构，结合生化实验均不支持TMEM120A具有离子通道活性（图2b） 【9-11】。
本研究验证了TMEM120A的疑似离子通道性质是否与其抑制寨卡病毒感染相关。作者向完全培养基中添加各种离子Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cu2+，Zn22+，Gd3+以观察它们对寨卡病毒感染的影响，Ca2+，Gd3+的添加会整体抑制对照组和TMEM120A过表达组寨卡病毒的感染，但是并不能消除对照组和TMEM120A过表达组之间的差异。另外，2020年Cell论文中描述的离子通道的关键氨基酸的突变均不影响TMEM120A的抗病毒功能。
由于TMEM120A与PIEZOs之间可能的关联，有关TMEM120A是否是机械刺激感受型离子通道的论战或将持续，但是，
TMEM120A是通过什么机制抑制了寨卡病毒感染呢？接下来，作者进一步进行了探究。 图2. TMEM120A（TACAN）的机械刺激离子通道活性尚存在争议; a. 2020年TMEM120A首次被报道能够感受疼痛刺激的离子通道 [8]；b. 2021年TMEM120A结构被报道，其机械力刺激离子通透性受到质疑 [9]，Mm: Mus Musculus，Hs: Homo sapiens
TMEM120A抑制寨卡病毒感染机制的研究之路 STING（又名TMEM173，MITA或ERIS）是细胞调动先天免疫来对抗DNA和RNA病毒不可或缺的蛋白【12】。考虑到TMEM120A与STING都位于内质网（ER）（图3a），作者探究了TMEM120A与STING的关联。本研究发现TMEM120A和STING可以共定位，且聚集呈现出大的荧光斑块（图3b），而且免疫共沉淀显示两者有直接相互作用（图3c）。进一步实验，作者发现TMEM120A过表达促进STING从ER向内质网-高尔基体中间体（ERGIC）转运（图3d），增强TBK1和IRF3的磷酸化，促进下游IFNB以及IFIT1，IFIT2，Mx1，Mx2，RSAD2，ISG15等干扰素刺激基因（ISGs）的表达，从而增强细胞整体的抗病毒先天免疫水平来抵抗病毒的感染。
值得注意的是，本研究显示TMEM120A不仅可以抑制寨卡病毒，登革病毒（DENV），黄热病病毒（YFV）等黄病毒科RNA病毒，而且可以抑制单纯疱疹病毒（HSV-1）等DNA病毒，与STING相似，具有广谱抗病毒特性。另外，作者尝试了用CRISPR-Cas9方法制备了TMEM120A敲除小鼠，发现TMEM120A全身敲除是胚胎致死的，无法用TMEM120A敲除小鼠进行病毒感染实验，所以，作者用TMEM120A敲除小鼠胚胎制备了胚胎纤维细胞（MEF），进一步验证了TMEM120A敲除会削弱细胞的先天免疫水平，促进病毒感染。
图3. TMEM120A与STING直接相互作用，促进STING转运，并激活下游信号通路; a. TMEM120A定位于ER（Calnexin为ER标记物）；b. TMEM120A与STING有共定位；c. TMEM120A与STING有相互作用；d. TMEM120A促进STING从ER到ERGIC的转运
纵观整篇论文，相对于CRISPR-Cas9等功能丧失型筛选系统，作者应用人类全基因组慢病毒过表达筛选系统，鉴定出了既能抑制RNA病毒（寨卡病毒，DENV，YFV），又能抑制DNA病毒（HSV-1）感染的全新宿主蛋白TMEM120A，通过对其抗病毒机制的探究，作者发现TMEM120A可以促进STING从ER到ERGIC的转运，增强TBK1和IRF3的磷酸化，促进IFNB以及ISGs的表达，从而整体上提升宿主细胞的抗病毒先天免疫（图4）。在抗病毒功能之外，TMEM120A敲除的胚胎致死效应，提示其在胚胎发育过程中还具有其它的重要生理功能，这些谜底的揭开还有待进一步研究。
图4. TMEM120A抗病毒机制的模式图
清华大学药学院博士后李硕和钱年超为本文的并列第一作者，清华大学药学院谭旭教授为本文的通讯作者。该工作得到了科技部重点研发计划，国家自然科学基金委，北京市结构生物学高精尖中心，生物结构前沿中心和清华-北大生命科学联合中心的资助。
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7. Wang, S. et al. Integrin alphavbeta5 Internalizes Zika Virus during Neural Stem Cells Infection and Provides a Promising Target for Antiviral Therapy. Cell Rep 30, 969-983 e964, doi:10.1016/j.celrep.2019.11.020 (2020).
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