简介 血友病（Hemophilia）是一种典型的遗传性疾病，由于与内源性、外源性和共同凝血途径有关的基因功能丧失而导致自发性出血( 1)血友病A和B是基因治疗最突出的靶点之一( 2)血友病最常用的治疗方法是预防，根据血友病的类型补充缺乏凝血因子。 腺相关病毒（AAV）基因治疗已经在临床上得到验证，并且已经证明在恢复缺乏凝血因子方面是有效的。 然而，这种方法不适用于使用因子VIII（FVIII）或FIX抑制剂的患者，后者分别约占血友病A和血友病B的30%和10%( 三)抑制剂是中和抗体，95%的严重血友病患者在FVIII替代治疗的前75天内产生抑制剂( 4)一。
最近，有人提出了不同的治疗策略来治疗抑制剂。 Emicizumab是美国食品和药物管理局（FDA）批准的双特异性抗体，已被临床用于治疗抑制剂患者，并涉及旁路策略，以模拟FVIII功能连接FIX和FX的下游凝血途径( 5)然而，这种方法要求患者在一生中反复注射。 Fitusiran是一种靶向抗凝血酶（AT）的RNA干扰疗法( 6)AT是一种内源性凝血酶负调节因子，由serpin家族C成员1编码( SERPINC1 )吉恩。 使用fitusiran抑制AT被证明是一种有效的旁路方法，可以在不直接表达凝血因子的情况下恢复凝血系统的平衡。 这种方法是一个有吸引力和多功能的策略，因为它适用于大多数血友病患者，而不管疾病的原因或抑制剂的发生。 然而，这种策略的一个局限性是菲图西兰的短期疗效( 6, 7)一。
到目前为止，所有被批准的治疗血友病的策略都会产生暂时的治疗效果。 然而，众所周知，反复治疗会对血友病患者的生活质量产生负面影响。 最近一段时间，血友病患者的预期寿命增加，因此需要更长时间的定期治疗( 8, 9)因此，获得持久和安全的长期疗效一直是治疗血友病最重要的考虑因素之一。 在这方面，基因治疗适合于维持长期的治疗效果。 值得注意的是，AAVs的治疗效果已经有好几年的报道( 10)和基因治疗研究使用各种AAV血清型正在进行。 然而，由于其免疫原性和随机整合性，其应用受到限制( 11, 12)一。
迄今为止，基因组编辑被广泛认为是治疗一些遗传性疾病和一些慢性病的有效策略( 13)提供基因组编辑工具的病毒和非病毒载体已应用于临床前模型，并且一些开创性的体内基因组编辑方法正在进行临床试验( 14– 16).与病毒载体方法相比，使用非病毒载体进行基因组编辑工具在安全性方面具有相对优势( 17).值得注意的是，非病毒途径不受有效载荷大小、预先存在的免疫或长期Cas9表达相关免疫原性的影响，这些都是使用病毒传递系统时遇到的一些主要限制。 Cas9蛋白可诱导天然免疫和细胞免疫应答( 18)，这种免疫原性与安全性相关，并阻止长期治疗结果，因为编辑细胞的溶解，在具有抗原呈递功能的细胞（如肝细胞）中更具威胁性( 19)相比之下，由于CRISPR-Cas9的瞬时表达，非病毒给药方法降低了靶向效应。 尽管CRISPR-Cas9的表达相对较短，但它足以在靶基因位点上进行编辑。 因此，近年来的研究主要集中在非病毒传递系统，如聚合物或脂质载体，作为体内基因组编辑治疗的更合适的传递工具( 20)一。
在这项研究中，我们假设CRISPR-Cas9-介导的编辑可能是治疗血友病a和B的一种长期和多功能的治疗选择。我们开发并优化了脂质纳米粒（LNPs），以将Cas9 mRNA和一个针对小鼠AT（mAT）的有效引导RNA（sgRNA）传递到小鼠肝脏。 接下来，在血友病A和B小鼠模型中评估mAT基因编辑介导的凝血酶生成，以确认所开发系统的治疗效果。 在这里，我们证明了使用LNPs在体内递送CRISPR-Cas9可以使AT基因编辑用于血友病A和B的持续治疗。
结果 体外筛选SERPINC1基因中有效的sgRNA筛选 用于血友病的mAT基因组编辑治疗( 图1A)，sgRNA候选目标 Serpinc1 外显子3是根据最小的靶外风险选择的（图S1A）。 11个不含2碱基对错配的sgRNAs用核糖核蛋白（RNP）转染小鼠C2C12细胞系。 插入或缺失（indel）频率通过靶向深测序分析。 通过初步筛选选择了三个sgRNA（图S1B），在随后的比较试验中，ts4sgrna被证明是最有效的( 图1B)C2C12细胞系转染良好，便于sgRNA活性的筛选，但在AT调控的背景下，C2C12细胞与靶细胞的关系并不密切。 因此，我们对SG4小鼠的原代RNA进行了一致性检测。 因此，在体外研究之后，我们选择ts4sgrna进行进一步的LNP介导的体内研究。
图1 选择AT位点作为再平衡的靶基因。
( A )CRISPR-Cas9介导的体内策略 Serpinc1 （编码）基因编辑。 红线和“X”符号表示基因表达或其功能受到抑制。 ( B )在第二外显子中选择单导rna（sgRNAs） Serpinc1 基因和双链断裂的潜力评估后，通过深度测序C2C12细胞与RNP配方。 转染和测序分三次进行，每个点表示每个实验的双链断裂频率。 TS，目标站点。 数据以平均值±SEM表示**** P <0.001。
缓冲液修饰法优化LNP在肝细胞转染中的应用 对于cas9mrna和sgRNA的体内传递，LNPs是使用246C10、二油酸磷脂酰乙醇胺（DOPE）、胆固醇和聚乙二醇（PEG）神经酰胺配制的。 本研究使用高度修饰的sgRNA，以期望的剂量有效诱导靶向基因组编辑。 在sgRNA的5′-和3′-端引入硫代磷酸键。 此外，2'- O -如前所述，甲基被引入sgRNA的茎环( 16)采用快速微流控混合系统制备了具有一定粒径和分布的LNPs( 图2A)在水相中，将Cas9 mRNA和mAT靶向sgRNA以1:1的重量比溶解在柠檬酸钠（pH 3）或醋酸钠缓冲液（pH 5）中。 利用微流控系统对cas9mrna和sgRNA进行共囊化，并对各种缓冲条件进行测试，以确定RNA分子的包封性。 我们观察到高度修饰的sgRNA导致RNA在LNPs中的封装效率低下（图S2）。 另外，根据sgRNA的化学修饰程度，sgRNA的包封效率也有很大的不同( 图2B)RNA包封率低（约50%），而SGA修饰的RNA包封效率低( P =0.0002）。
图2 制备了CRISPR-Cas9介导的体内基因编辑用LNPs。
( A )使用微流控混合系统的LNP配方示意图。 ( B )分析了末端修饰和高度修饰的sgRNA在7mm柠檬酸缓冲液中的包封效率（EE）( n =5）。 在sgRNA结构中，星号和红色字体表示硫代磷酸酯键和2′- O -甲基核糖核酸。 数据以平均值±SEM表示*** P <0.001。 ( C )分析了不同缓冲条件下LNPs的EE、size和PDI。 本研究中选择的条件用蓝色表示。 ( D )通过活体生物发光成像分析生物分布。 mFlucLNPs是用 卢克 mRNA（0.1mpk剂量）静脉注射C57BL/6小鼠。 注射3小时后，在活体小鼠及其器官中检测到发光信号。
先前的研究已经证明，使用高度修饰的sgRNA比末端修饰的sgRNA能产生更好的基因组编辑效果( 16, 21)因此，我们试图优化缓冲条件，以确保高度修饰的sgRNA被封装在LNPs中。 在不同浓度的氯化钠（NaCl）存在下，研究了柠檬酸盐和醋酸盐缓冲条件对sgRNA包封的影响。 离子缓冲强度和pH值是微流控混合过程中的重要参数。 低pH（10mm，ph3）的柠檬酸盐缓冲液常被用来制备RNA包裹的LNPs，以减少RNA的碱水解。 此外，柠檬酸缓冲液中的大多数可电离脂质胺都带正电荷（246C10可电离脂质的pKa为6.9），这使得可电离脂质具有与带负电RNA静电相互作用的优势。 然而，我们试图在高pH值（50mm，ph5）下考察醋酸盐缓冲液的效果。 因此，我们确定用柠檬酸盐缓冲液制备的高修饰sgRNA包封LNPs的包封效率较低（68%），且为单分散[多分散指数（PDI）<0.1]。 相比之下，用醋酸盐缓冲液制备的高修饰sgRNA包封LNPs具有较高的包封率（96%），且具有相对较高的异质分散性（PDI>0.9）( 图2C)考虑到在微流控混合过程中使用柠檬酸盐缓冲液可以产生单分散的LNPs，因此我们在微流控混合过程中选择了柠檬酸盐缓冲液。 此外，我们在微流控混合过程中加入NaCl以提高离子强度和封装效率。 以前，芬恩 等等。 ( 16)在微流控混合过程中加入了NaCl，使高度修饰的sgRNA具有较高的包封效率。 在此基础上，优化了缓冲液中NaCl的加入量。
在微流控混合过程中，添加到缓冲系统中的NaCl量明显影响sgRNA在LNPs中的包封率( 图2C)当只处理cas9mrna时，这种影响可以忽略不计； 然而，高度修饰的sgRNA需要一定量的离子强度才能被包裹。 在优化的条件下（7 mM柠檬酸盐和20 mM NaCl），共囊化Cas9 mRNA和mAT-sgRNA的包封率超过90%，PDI较窄。 在这些结果的基础上，我们选择了这种比初始配方具有更好的RNA包封率（>90%）的缓冲条件，以供进一步研究。 接下来，通过静脉途径引入含有LNP的荧光素酶来证实LNP的器官特异性传递潜力。 值得注意的是，小鼠肝脏表现出高转基因表达，但其他器官没有显示可检测到的荧光素酶表达( 图2D)一。
Spcas9和sgRNA对mAT的持续下调作用 在优化LNP CRISPR肝细胞输送材料后，尝试体内mAT靶向治疗。 在人类中，血友病A和B是凝血障碍的典型类型，而mAT表达下调导致血友病A和B的临床症状改善( 7, 22, 23)血友病A是血友病中最常见的类型，是一种严重的凝血障碍，它是由 FVIII公司 基因（F8 I22I公司 ) ( 24)另一方面，血友病B是由 修复 基因（F9 穆特 )。因此，小鼠用F8 I22I号 和F9 穆特 用于本研究； 这些小鼠是通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑产生的，并证实了血友病的表型。 作为试验剂量，我们每隔2周通过静脉途径给每只小鼠1.2mg/kg（mpk）( 图3A)在较低的荧光素酶mRNA剂量下，生物发光信号易于检测； 然而，需要更高的剂量才能在靶细胞中产生与治疗相关的Cas9蛋白( 25, 26)LNP CRISPR垫仅在肝组织中产生可检测指标( 图3B在F8的肝组织中观察到平均22%和38%的indel频率 I22I公司 和F9 穆特 分别是( 图3C)同时，LNP-CRISPR-mAT产生了一个显性的1-2bp的移码缺失，从而增加了mAT的功能丧失( 图3D)一。
图3 .LNP CRISPR mAT诱导mAT表达的长期下调。
( A )使用LNP CRISPR mAT进行体内基因靶向的简要示意图。 C57BL6（B6， n =4），B6。 FVIII内含子22反转（F8 I22I公司 , n =每组4个），以及B6。 固定敲除（F9 穆特 , n =每组4只）在本研究中使用小鼠。 ( B 和 C )用T7E1基因测序法对各组进行测序，并进行测序。 数据显示为平均值±SEM。 ( D )根据帧移和索引大小（每组3或4个）对索引模式进行分析。 每个点表示每个大小索引在总排序结果中的百分比。 ( E )以B6小鼠为实验对象，用ELISA法筛选AT持续下调( n =每组6个）。 用柠檬酸钠包被管从尾静脉采集血液，并对血浆进行mAT-ELISA检测**** P <0.0001。 ( F )测量并比较LNP CRISPR mAT治疗组和对照血友病小鼠组的血mAT浓度。 每个点表示单个小鼠的mAT浓度（每组3个或4个）。 数据以平均值±扫描电镜表示** P <0.01和*** P <0.001； ns，无意义。
由于在肝组织中观察到双链DNA断裂，因此通过评估血mAT浓度来评估mAT功能。 当我们每隔2周给药三次LNP CRISPR mAT，我们在这期间用野生型（WT）小鼠反复分析血mAT浓度。 随着反复注射LNP-CRISPR-mAT，mAT浓度下降，但在第一次注射LNP-CRISPR-mAT后10周，mAT浓度趋于稳定( 图3E)因此，当高度修饰的sgRNA和SpCas9 mRNA被包装在LNP中并反复给药时， Serpinc1 与对照组小鼠的平均mAT值相比，基因功能下降了70%以上，并且 Serpinc1 此后10个月内，下调水平保持稳定。 虽然对照WT小鼠通过重复取样分析基因表达变化是有用的，但是需要注意的是，对照WT小鼠和血友病小鼠模型的mAT表达可能不同。 因此，将LNP CRISPR mAT用F8给小鼠 I22I公司 和F9 穆特 并测定血mAT浓度。 我们观察到F8的血mAT浓度下降了约40% I22I公司 在F9有70% 穆特 老鼠( 图3F)一。
LNP-CRISPR-mAT对血友病小鼠的挽救性凝血酶生成活性 在评价凝血障碍的各种诊断方法中，活化部分凝血活酶时间（aPTT）试验和校准自动凝血酶（CAT）生成被广泛应用( 27)然而，aPTT适用于评估凝血潜能的初始阶段，因此，它不适用于分析再平衡的治疗效果( 28)另一方面，CAT可以测量100分钟以上的凝血酶生成，适用于评价再平衡效果( 6)值得注意的是，LNP CRISPR mAT处理恢复了F8的凝血酶生成潜能 I22I公司 和F9 穆特 老鼠。 LNP-CRISPR-mAT缩短了F8的滞后时间，提高了凝血酶峰值，增加了总凝血酶生成量（曲线下面积） I22I公司 和F9 穆特 此外，LNP CRISPR-mAT处理可使凝血酶峰值提高约为WT的65%。根据使用血栓图确定的凝血酶峰值和总凝血酶形成能力，我们注意到LNP CRISPR-mAT治疗增强了F8小鼠的凝血酶生成能力 I22I公司 和F9 穆特 ( 图4，A和B)一。
图4 体内mAT靶向挽救血栓形成。
( A 和 B )来自F8的等离子 I22I公司 和F9 穆特 从下腔静脉收集小鼠（对照组， n =5； 8楼 I22I公司 ，第8层 I22I公司 -LNP，F9 穆特 ，和F9 穆特 -LNP公司， n =4）。 计算并分析血栓形成的滞后时间、凝血酶峰值、凝血酶峰值时间和曲线下面积。 每个点表示来自一个鼠标的数据，表示平均值±SEM* P <0.05** P <0.01和*** P <0.001。 对WT小鼠的血栓形成进行一次评估，并与F8进行比较 I22I公司 和F9 穆特 老鼠。
通过增加血栓形成潜能减少自发性出血和继发性血友病并发症 由于CAT介导的凝血功能得到改善。 然而，评估自发性出血（血友病的一个重要并发症）的减少也是必要的。 血友病患者最常见的自发性出血部位是大脑和关节( 29, 30)然而，我们没有观察到血友病小鼠的大脑和关节出血病变（图S4）。 组织病理学分析显示两组血友病小鼠肝间质区有自发性出血( 图5A)通过测量组织切片中检测到的红细胞总数来验证出血的频率或严重程度。 因为红细胞具有自体荧光( 31)，将470和530nm波长共表达产生的假黄色信号定义为红细胞产生的自体荧光。 从每只小鼠的肝脏中随机选取10个区域，并对黄色荧光信号的维数比进行量化。 正如预期的那样，LNP CRISPR垫治疗降低了肝组织中红细胞的频率，表明自发性出血减少。 尤其是，每只小鼠的mAT浓度与红细胞频率之间存在显著相关性( P =0.0065）( 图5A)一。
图5 血栓形成增强可减少自发性出血和继发性血友病并发症。
( A )石蜡包埋的肝组织在不灌注的情况下制备，以防止自发性出血（WT， n =3； 8楼 I22I公司 ，第8层 I22I公司 -LNP，F9 穆特 ，和F9 穆特 -LNP公司， n =4）。 免疫荧光染色法检测470和540nm处的自体荧光信号，检测肝间质中的红细胞【用苏木精-伊红（H&E）染色法在肝组织中标记黑色三角形】。 然后计算共表达的强度（黄色信号）。 从每只小鼠的肝脏中随机选取10个区域，并对每个测量到的自体荧光信号进行红细胞频率分析。 每个点表示来自一个选定区域的信号。 用每只小鼠的平均黄色荧光值进行相关分析。 蓝点，LNP CRISPR垫组； 红点，对照组。 比例尺，100μm( B )全肾福尔马林固定，大体组织学检查采用H&E染色。 从皮质随机选择的三个区域（1 mm）计算异常形状的肾小球囊（黑色三角形）的数量 2 )每只老鼠进行分析** P <0.01和*** P <0.001。
血友病患者的肾脏损害并不常见( 32)但在本研究中观察到肾脏的意外组织学变化。 两个F8 I22I公司 和F9 穆特 血友病小鼠在鲍曼胶囊中表现出典型的水肿症状( 图5B)然而，在对照WT小鼠中没有检测到这些症状。 因此，我们也评估了LNP CRISPR垫对肾脏的治疗效果。 为此，我们从每只老鼠的肾脏中随机选取三个切片，分析鲍曼胶囊的形状。 LNP-CRISPR-mAT治疗减轻了水肿症状，并使F8中的肾小球包膜的总比例降低 I22I公司 和F9 穆特 小鼠与对照组小鼠相似( 图5B)总之，这些观察结果证实，通过LNP CRISPR mAT治疗的再平衡导致mAT浓度持续降低，从而改善血友病的临床症状。
未检测到CRISPR-LNP介导的副作用 在活体基因编辑中，最关键的并发症是出现不良的靶向效应。 因此，我们首先使用电子显微镜方法选择了七个最高电位的非靶点，这些位点与靶点上的sgRNA序列相差最多3个核苷酸（表S1）。 另外，利用双基因组序列进行全基因组检测( 33)我们发现了另外三个潜在的位点，这些位点的卵裂分数明显低于靶位点( 图6A以及表S1）。 接下来，在用LNP CRISPR mAT处理的小鼠肝脏中验证了总共10个不符合目标的候选者。 利用来自对照组WT，F8的肝基因组DNA进行靶向深度测序分析 I22I公司 ，和F9 穆特 ( n =3，每个）在两个血友病模型中，在潜在的非靶点没有显示有意义的指标( 图6B)一。
图6 LNP-CRISPR-Cas9的安全相关评估。
( A )TS4SGRNA缺失（粉红色）或存在（蓝色）时体外切割位点的全基因组圆环图。 括号内数字：乳沟得分。 红色箭头：目标劈开( B )对前7个同源候选（off）和Digenome-seq分析（Di-Offs）检测到的3个候选基因的靶向深度测序结果( n =3）。 ND，未检出*** P <0.001。 ( C )每隔2周注射1.2 mpk LNP CRISPR mAT三次给WT后的血清AST和ALT浓度( n =6）。 ( D )血清TNF-β-1或TNF-β-1注射三次后。 阳性对照组注射脂多糖20mpk( n =4）。 ( E )反复注射LNP CRISPR mAT后血清抗SpCas9 IgG浓度( n =3）。 小鼠静脉注射AAV9-EFS-SpCas9（5×10 13 vg/kg）也在治疗6周后进行测试。 根据ELISA标准曲线计算浓度( R 2 =0.989）。 ( F )CD8中IFN-γ表达的典型流式细胞术图 + T细胞。 IFN-γ在CD8中的表达 + 重复注射PBS、空LNPs和sgRNA/Cas9 mRNA包封的LNP后，评估T细胞( n =3）。 详细结果如图S5所示。
LNP-CRISPR的另一个实质性安全问题是免疫反应或炎症。 血浆用于天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转移酶（ALT）分析，两组间差异不大。 因此，LNP CRISPR mAT给药不会导致肝损伤( 图6C)接下来，通过测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）浓度来评估LNP-CRISPR的炎症反应。 注射LNP-CRISPR后，炎症细胞因子的产生没有明显增加( 图6D)此外，我们用注射LNP的小鼠血清，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）研究了系统性抗Cas9抗体的反应。 与LNP空处理相比，反复注射LNP CRISPR-mAT不能诱发抗Cas9免疫球蛋白G（IgG）( 图6E)然而，当我们静脉注射AAV-Cas9时，在治疗6周后检测到系统性升高的抗Cas9-IgG( 图6E)这表明反复注射LNP-CRISPR比持续AAV介导的Cas9表达相对较少免疫原性。 接下来，我们评估了重复给药sgRNA/cas9mrna包封的LNPs是否会诱导对表达Cas9蛋白的细胞的细胞免疫应答。 因为细胞免疫反应是由CD8特异性介导的 + 细胞毒性T淋巴细胞，证实小鼠脾细胞中存在抗Cas9的T细胞( 34)通过测定小鼠脾细胞Cas9蛋白攻击后干扰素-γ（IFN-γ）水平。 反复注射LNP不能诱导小鼠产生细胞免疫反应( 图6F以及图S5）。
讨论 血友病是一种X连锁隐性遗传病，主要由功能缺失突变引起 FVIII公司 或 修复 基因( 35)尽管临床上广泛使用缺乏凝血因子蛋白的预防措施，但频繁给药、昂贵的费用和抑制剂的发生率都会对患者的生活质量产生负面影响( 36)因此，目前正在制定先进的治疗策略来解决这个问题。 在这项研究中，我们评估了 SERPINC1 编码AT可以作为治疗血友病患者的一种潜在的高级治疗选择。 我们证明，LNP介导的CRISPR-Cas9在血友病A和B小鼠模型中均能抑制mAT，改善凝血酶生成和出血相关表型。 值得注意的是，使用LNP CRISPR mAT可为使用或不使用抑制剂的患者提供灵活的治疗机会，即使在有限的剂量下也能产生长期的治疗效果( 7)此外，我们还证明了非病毒传递的SpCas9和sgRNA有效地靶向肝脏 Serpinc1 没有明显的偏离目标的效果。 因此，这种CRISPR-Cas9兼容的给药工具也可能具有潜在的临床应用价值。 最近，使用LNP-CRISPR-Cas9的类似方法对转甲状腺素（ATTR）淀粉样变性患者进行了人体试验（NCT04601051）。 crisp90%的crisp9仅能有效抑制TTR-9的不良反应( 37)论证了该方法的翻译可行性。
凝血途径再平衡的治疗应用受到大力鼓励，因为观察到血友病患者的出血表型显著改善，他们共同遗传了抗凝因子（如AT和组织因子途径抑制剂（TFPI））的缺陷( 38, 39).AT抑制各种凝血相关基因，如 因子XIIa , 夏 , 伊克萨 , Xa公司 , 威亚 ，和 凝血酶 ( 国际投资协定 ) ( 40)，同时 TFPI公司 可逆抑制 因子VIIa 和 Xa公司 ( 41)因此，AT或TFPI功能的丧失可通过降低其抗凝活性来恢复受损的平衡。 使用单克隆抗体的TFPI靶向方法，包括concizumab和marstacimab，已经进行了临床试验。 然而，所涉及的临床方案是每天和每周一次注射康体单抗和马司他单抗( 42)因此，基因组编辑 TFPI公司 似乎是一种更持久有效的策略，并且有一些有效的sgRNAs靶向性 TFPI公司 在人类基因组中观察到（图S6）。 值得注意的是，TFPI由不同的细胞类型表达( 43)而靶向多个组织的给药方法的发展可能有助于肿瘤的临床转化 TFPI公司 -编辑方法。 相反，我们建议 SERPINC1 -编辑策略可能是一种更快的方法，因为在这项研究中开发的传递工具对肝脏非常有效，肝脏是at分泌的主要来源。 一些针对人类的sgRNAs SERPINC1 通过敲除框架诱发无稽部分。 因此，这些sgRNA候选者可以被考虑用于下一个导联优化阶段。
致力于新技术开发的巨大努力在治疗各种难治性疾病方面作出了贡献( 44, 45)特别是AAV介导的基因替代疗法现在被广泛接受作为长期治疗的选择，而不是蛋白质替代或抗体介导的治疗。 在血友病患者中，AAV-FVIII的临床试验同样证明了给药后几年内，FVIII水平下降，而AAV-FIX试验显示其持续作用超过10年( 46, 47)这种下降的原因尚未证实，但可能与肝细胞中FVIII的表达或分泌有关，而不是FVIII的内源性来源。 直接纠正常见突变的基因组编辑策略，如第22内含子或第1内含子的反转 FVIII公司 已经被提议( 48)然而，正弦内皮细胞靶向给药系统和高逆转效率的要求限制了这种方法的应用。 因此，其他旁路策略与长期治疗方法相结合可以帮助克服现有方法治疗效果持续时间短的局限性。 我们假设 SERPINC1 -编辑策略是一个很好的治疗选择，允许广泛的目标人群。
在本研究中，我们应用LNPs来运送CRISPR-Cas9。 连续三次重复给药LNP处理可抑制F8中AT表达约40%和70% I22I公司 和F9 穆特 分别是老鼠。 此外，在两种血友病模型中，抑制水平都伴随着表型恢复。 因此，AT抑制的治疗窗可小于50%； 然而，需要进一步的研究来详细剖析最低有效调节水平。 LNP的优点之一是易于重复给药，由于其具有高度的抗囊免疫反应，不适合于AAV( 49)值得注意的是，onpattro，一种FDA批准的LNP-短发夹RNA抑制ATTR可以每3周注射一次( 50)一些有效的LNP如C12-200、MC3和cKK-E12已被报道有效地靶向肝脏( 51)这些可以通过部分应用可生物降解的脂质来进一步优化( 52)同样，我们的原型LNP可以进一步优化颗粒的生物降解性或内体释放，从而有助于开发更具临床相容性的输送工具。
我们在评估用同源性和全基因组检测方法选择的候选基因组位点时，没有观察到任何活动的非靶点。 虽然我们使用了双基因组序列，但其他方法，包括循环序列、改变序列和引导序列，也适用于涉及体外或基于细胞的基因组全切以及下一代测序的方法( 53)在最近使用CRISPR-Cas9进行的临床项目中，捕捉潜在非目标基因座的有偏和无偏方法的组合已用于IND（研究性新药申请）批准( 15, 37)因此，利用靶向深度测序结合多次非靶向检测方法的位点特异性验证可以作为验证基因组编辑策略翻译适用性的标准方案。 同时，考虑到非目标削减策略，一些工程化的高保真版本的Cas9，如HFCas9、eCas9、HypaCas9和SniperCas9可作为WT SpCas9的替代品( 53– 55)一。
总之，我们提供了一种新的、基于CRISPR-Cas9的治疗血友病的方法。 据我们所知，之前没有报道显示CRISPR-Cas9介导的AT基因编辑非病毒载体和治疗血友病的效果。 我们的基因组编辑方法提供了一个多功能的选择来解决各种未满足的需求，这些需求持续存在于主要的先进疗法中，包括基因替代疗法或其他绕道疗法。
材料和方法 sgRNA筛选 小鼠C2C12[美国型培养收集（ATCC）、CRL-1722]细胞或人Jurkat（ATCC，TIB-152）细胞保存在杜尔贝克改良的基本培养基中，该培养基补充有4 mM谷氨酰胺（4.5 g/L）、1 mM丙酮酸钠、10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）。 对于最初的sgRNA筛选，编码人类优化的SpCas9和sgRNA或RNP复合物的质粒由4μg Cas9和1μg sgRNA形成，使用10μl的tips在1150 V下对氖气转染（Life Technologies，Carlsbad CA，USA）施加15 ms和两个脉冲。 作为附加对照试验，小鼠原代肝细胞（4×10） 5 细胞）用1μg LNP处理三个选定的sgRNAs（TS2、TS4和TS11）。 转染3天后，收集细胞，用DNeasy血液和组织试剂盒（德国Hilden，Qiagen）提取基因组DNA，进行靶向深度测序，测量indel频率。
LNP准备 LNP采用NanoAssembler台式仪器（加拿大温哥华市精密纳米系统公司）按照先前描述的方法制备( 26)将脂质组分（26.5:20:52:1.5摩尔比的电离脂质、兴奋剂、胆固醇和PEG脂质）溶解在乙醇中，RNAs（Cas9 mRNA/sgRNA重量比为1:1）溶解在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 3）中。 最终可电离脂质与RNA的重量比为10:1，最终体积比为1:3。 然后，以12ml/min的流速通过微流控混合制备的溶液来制备LNPs。 使用3500分子量截止透析盒（Life Technologies）对1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）透析16小时，以交换缓冲液。 为了对制备的LNPs进行表征，采用动态光散射法确定了LNPs的尺寸、PDI和zeta电位。 采用定量核糖绿分析法（Life-Technologies）测定rna的包封效率。
生物体内分布分析 C57BL/6小鼠体重为18~20g，从Orient Bio（韩国京畿道首尔）购买。 小鼠静脉注射萤火虫荧光素酶mRNA的LNPs（剂量为0.1mpk）。 三小时后，小鼠被注射 d -荧光素腹腔注射并孵育15分钟。使用IVIS（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市Perkin Elmer）进行全身和体外器官的生物发光成像。 所有动物研究程序均由EWA女子大学机构动物护理和使用委员会（机构动物护理和使用委员会19-022）批准。
LNP-CRISPR的动物实验 C57BL/6（B6）小鼠购自Koatech（韩国京畿道平台）。 B6。 FVIII内含子22反转（F8 I22I公司 )还有B6。 固定敲除（F9 穆特 )由基于CRISPR-Cas9的基因编辑生成（图S7）( 56).对7至9周龄雄性小鼠进行进一步的实验。 将B6和每只血友病小鼠随机分为两组，其中半数分别注射LNP包装的spcas9mrna和高度修饰的sgRNA（LNP-crisprmat）3次，间隔2周。 通过将1.2 mpk LNP CRISPR垫和高达600μl的温生理盐水混合制备注射溶液，并通过静脉途径注射。 600μl注射液不能诱导肝内的水动力基因传递（图S8）。 B6小鼠经尾静脉重复采血18周。 血友病小鼠在第一次注射LNP-CRISPR-mAT后8周被安乐死。 从下腔静脉采集新鲜血液450μl，与50μl 3.2%柠檬酸钠混合，离心后收集上清液制备血浆。 采血后不经灌注采集各器官，部分组织用福尔马林固定，剩余部分用于基因组DNA提取。 本研究由首尔国立大学动物护理和使用委员会（SNU-200715-2）批准，并根据批准的指南进行。
靶向聚合酶链反应 用G-DEX-IIc基因组DNA提取试剂盒（韩国京畿道内含子生物技术）从器官组织中提取基因组DNA。 设计引物用于扩增LNP CRISPR mAT靶向基因组区域。 接下来，在T7E1分析中，聚合酶链反应（PCR）扩增产物进行异源双链杂交和T7E1内切酶（美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室）培养30分钟。 凝胶电泳中剪切带的存在被认为是indel形成。 对于靶向深度测序，从转染细胞或注射LNP的组织中提取基因组DNA，通过PCR扩增出感兴趣的基因组区域。 在随后的PCR过程中，使用Illumina TrueSeq适配器对产生的扩增子进行条形码编码。 用PCR纯化试剂盒（韩国首尔Geneall）对产物进行纯化，然后以等摩尔比混合。 使用Illumina Miseq v2（PE150）（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina）对最终的库进行配对末端测序。 用Cas分析仪对Indel频率进行定量分析( www.rgenome。网)原间隔区相邻基序序列上游3-bp区域的Indels被认为是Cas9引起的突变。
酶联免疫吸附试验 使用mAT-III ELISA试剂盒（英国剑桥Abcam）用ELISA法测定血液浓度。 根据制造商的说明使用血浆进行酶联免疫吸附试验。 在450 nm处用分光光度计（瑞士苏黎世Tecan）测量吸光度，并通过将测量的光密度值应用于标准曲线来计算浓度。 AST和ALT用AST/ALT活性测定试剂盒（美国德克萨斯州休斯顿市Apexbio）测定。 血浆分别用1:9和1:3稀释，用于AST和ALT分析。 AST/ALT测定按照制造商的说明进行。 用分光光度计（瑞士苏黎世Tecan）分别在450和570 nm处测量吸光度，用于AST和ALT分析。 为了分析炎性细胞因子的产生，WT小鼠每隔7天向尾静脉注射1.2mpk的LNP或LNP CRISPR mAT三次。 最后注射后24小时内，从前腔静脉采血，用ELISA法测定血清TNF-α和IL-1β浓度（bios，Woburn，MA，USA）。
校准自动血栓仪（CAT） 使用技术凝血酶TGA试剂盒（美国俄亥俄州西切斯特市，Shifarma）测量凝血酶生成。 简言之，将40μl血浆稀释液、10μl试剂C低缓冲液和50μl底物的混合物添加到单孔中，并以1分钟的间隔测量360/450 nm处的荧光（激发/发射）120 min。 使用Cytation 5在96孔板中进行凝血酶生成的荧光测量（BioTek，Winooski，VT，USA）。 使用制造商提供的软件计算凝血酶生成曲线。
组织学分析 苏木精-伊红染色时，脱蜡组织用0.1%的Mayer's H&E液染色。 用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色脱去脂肪组织，用cytion5（BioTek）检测470和530nm波长的信号。 通过显微镜采集图像后，用ImageJ程序（美国马里兰州洛克维尔派克NIH）对图像进行分析。 将所有图像转换为8位灰度，然后选择“调整>阈值”命令下的“图像”。 用ImageJ软件自动测量每幅图像的平均值。
目标外分析 潜在的偏离目标的地点首先是使用一个电子工具，即offfinder( www.rgenome。网)含有高达3-bp错配的小鼠基因组位点被认为是非靶点，并通过靶向深度测序进一步证实。 通过Digenome-seq获得额外的目标外候选( 33).简而言之，在适当的缓冲液[100 mM NaCl，50 mM tris HCl，10 mM MgCl]中，用SpCas9（300 nM）和sgRNA（900 nM）体外切割人类基因组DNA（8μg） 2 和牛血清白蛋白（100μg/ml）]，纯化消化后的DNA，并使用Covaris系统（Life Technologies）和末端修复混合物（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）生成初始文库。 DNA片段的末端与适配器连接，最后的文库通过Illumina HiSeq X Ten测序仪（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina）通过WGS（全基因组测序）进行测序。 将测序结果映射到小鼠基因组参考GRCm38后，使用Digenome-seq工具分析产生的BAM文件( www.rgenome。网)将卵裂得分大于2.5的基因座作为潜在的非靶位点，并通过靶向深度测序进一步验证。 表S1和S2分别列出了非目标候选的靶位点和引物信息。
T细胞刺激与细胞内细胞因子染色 给小鼠注射三次空的LNP、sgRNA/Cas9 mRNA-封装的LNP和PBS。 最后一次注射后24小时，从小鼠脾脏制备单细胞悬浮液。 电池（1×10 6 )分别与2.5μg重组Cas9（Cas9）或phorbol 12肉豆蔻酸13醋酸盐（PMA）（50ng/ml）和离子霉素（1μg/ml）单独培养18小时。 为了测量产生IFN-γ的细胞，用brefeldin A（eBioscience Inc.，San Diego，CA，USA）进一步处理脾细胞5小时。 用含0.5%的荧光标记物进行细胞分选。 使用CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）获取染色细胞，并使用FlowJo软件（TreeStar Inc.，Ashland，OR，USA）进行分析。 使用的抗体是抗原呈递细胞（APC）/Cy7抗小鼠CD3（BioLegend，San Diego，CA，USA，100706）、异硫氰酸荧光素（FITC）抗小鼠CD8（BioLegend，100222）和藻红蛋白（PE）抗小鼠干扰素-γ（BioLegend，505808）。
抗Cas9抗体反应的测定 ELISA法检测抗Cas9抗体反应。 简单地说，在37℃下用0.1μg每孔SpCas9蛋白（Aldevron，9212）包被96孔板3小时。随后，将平板清洗四次，然后通过添加100μl分析稀释液缓冲液（BioLegend，421203）在25℃下封闭1小时。将注射有LNP CRISPR mAT或AAV9-Cas9的小鼠血清稀释40倍， 将培养皿与样品在25℃下培养2小时。洗涤后，用抗小鼠IgG-结合辣根过氧化物酶（HRP；Sigma，A9044；Sigma-Aldrich）培养皿，随后洗涤，然后用三甲基硼（TMB）底物（BioLegend，421101）处理。 在使用停止溶液（BioLegend，423001）停止HRP/TMB反应后，在450 nm处进行吸光度测量。 用市售小鼠抗Cas9抗体（Abcam，191468）作标准曲线试验，并与标准曲线进行比较( R 2 =0.989）用于测定受试样品的抗Cas9 IgG浓度。
统计分析 对未配对的学生进行统计学分析 t 使用GraphPad Prism（5.02版，GraphPad，San Diego，CA，USA）进行测试和相关性分析。
