单细胞RNA-seq揭示癌症疼痛：神经元样巨噬细胞亚群与癌症疼痛相关

癌症患者往往会经历疼痛折磨，其机制是什么？香港中文大学的研究人员揭示一种巨噬细胞亚群在肿瘤微环境下表现出神经元样表型，并多角度证实其与癌症疼痛相关，这可能成为癌症疼痛的治疗靶点。

　　

背景
癌症仍然是全世界死亡的主要原因。许多恶性肿瘤的患者要忍受慢性疼痛，晚期肺癌、乳腺癌、前列腺癌或胃肠道癌患者尤甚，这严重影响了他们的生活质量。阐明癌症疼痛的潜在机制对于指导治疗的发展相当重要。 

一般认为，癌症疼痛部分是由肿瘤微环境（TME）中的组织损伤和炎症引起的，但其机制尚不清楚。慢性炎症往往与癌症的发展和进展有关，目前尚不清楚慢性炎症如何驱动癌症并发症——尤其是慢性疼痛的发生。一直以来神经元可塑性被认为是慢性疼痛发生和维持的关键机制。通常在外周组织损伤和炎症后，会出现伤害险感受器（nociceptor）水平上的末梢致敏，这个过程是将急性损伤感受转变为慢性疼痛的关键。伤害性感觉神经元不仅对免疫信号作出反应，而且能直接调节炎症反应——沉默伤害感受器可以减少过敏性气道的炎症足以证明这点（神经细胞参与免疫）。

越来越多的证据表明，包括巨噬细胞在内的许多非神经元细胞类型在痛觉中起着重要作用。有研究提出巨噬细胞在外周疼痛调节中的新作用。在小鼠中耗竭巨噬细胞，而不是中性粒细胞或T细胞，能有效地减少切口的发展和病原体引起的机械和热敏感性，伴随着炎症部位白细胞介素-1β（IL-1β）和其他促痛觉介质的下调。巨噬细胞也被发现通过间接释放抗炎介质，如IL-10和专门的促溶解介质来影响镇痛。（免疫细胞参与痛觉）

研究亮点

香港中文大学的研究人员成功利用单细胞RNA测序分析巨噬细胞在组织炎症和癌症条件下转录组的动态变化，发现了一种直接促进肿瘤神经发生的“巨噬细胞-神经元样细胞转化”（“macrophage to neuron-like cell transition”，MNT）现象，并在肺癌模型中进行了巨噬细胞耗竭和命运定位研究，确定巨噬细胞特异性Smad3是在基因组水平上促进MNT的关键调节因子；它的破坏有效地阻断了肿瘤的神经支配和体内肿瘤依赖性的伤害行为。因此，“巨噬细胞-神经元样细胞转化”（MNT）可能是癌症疼痛的精确治疗靶点。

1. 作者用流式分选从LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠 LLC肺癌模型的肿瘤中分离出巨噬细胞谱系的细胞，进行10×Genomics scRNA-seq分析——单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种在基因组范围内分辨细胞异质性的新兴方法，它可以用于分辨发育过程或者外部刺激过程中的转录网络时序，这种信息通常在群体分析中被掩盖了；而在肿瘤微环境中的转录组特征和表型是高度动态的——由于癌细胞的刺激，巨噬细胞的表型可以通过转录调控迅速改变。他们发现一组高度表达神经元分化标志物Tubb3的肿瘤相关巨噬细胞（TAM），根据MetaCore生物信息学平台的GO分析（gene ontology），其上调的差异表达基因与神经元生成高度相关。研究人员发现在活体中的这种LLC肿瘤的Tubb3⁺ TAM细胞转录水平上表现为巨噬细胞标志物表达缺失，而神经生成相关基因（如Map1b, Syt13, Cyb5d2, Pax6, Cdon, Wnt5a, Pex2等）表达。双光子活体成像进一步证实了这种具有神经纤维样形态的巨噬细胞谱系(tdTomato+)衍生细胞的存在，其钙外排水平(OGB-1+)增强。脂质体氯膦酸盐介导的巨噬细胞耗竭消除了LLC肿瘤中这种神经元样亚群的形成，Tubb3⁺ TAM细胞的存在与癌症相关疼痛反应行为显著相关。

作者还在10×Genomics的 scRNA-seq人类非小细胞肺癌(NSCLC)活检数据集中发现了TUBB3⁺CD68 TAM亚群（有包括BMP7、SHANK、CHL1和PAX6等神经元基因的强表达）。这个前所未知的TUBB3⁺ TAM亚群显示出与TUBB3⁺神经元细胞类似的神经元样转录组特征，与人类神经疾病高度相关。在人肾细胞癌和肝细胞癌中也发现了这种神经元样TAM亚群的存在，并在大规模的NSCLC患者活检中进一步证实。通过共聚焦三维成像可视化在NSCLC中的TAM亚群，并通过流式细胞分析检测其肿瘤特异性定位，比较NSCLC和正常肺组织，表明TUBB3⁺ TAM亚型在腺癌NSCLC中高度存在，并与人TME中神经元分化标志物TUBB3的表达呈正相关。值得注意的是，TUBB3⁺ TAMs的丰度(TUBB3⁺ CD68⁺/CD68⁺比值> 30%)与老年NSCLC患者较差的生存率显著相关，它们上调的差异表达基因与神经疾病高度相关(亨廷顿舞蹈病、帕金森病和阿尔茨海默病)，表明这个前所未知的肿瘤相关巨噬细胞TAM子集对神经发生的潜在贡献。

2. 为了更好地理解Tubb3⁺ TAM亚群在肿瘤神经发生中的动态和潜在贡献，作者使用最新的生物信息学平台RNA速率分析—— 一个RNA转录和剪切的动力学模型，用于评估单个细胞从而进行最终分化细胞与亲本细胞之间的因果推断——对Tubb3⁺TAM数据进行分析，两种方法（RNA速率和MuTrans分析方法）均证实Tubb3⁺ TAM亚群来自巨噬细胞谱系。共聚焦成像技术在活体LysM^-Cre/ROSA^-tdTomato小鼠LLC肿瘤中观察到巨噬细胞系来源的Tubb3⁺细胞，占流式细胞术和图像分析检测到的肿瘤Tubb3⁺细胞总数的90%以上。为了确认巨噬细胞在TME中直接转变为神经元样细胞的可能性，通过拟时间分析其发育阶段的关系，结果证实了肿瘤微环境中Tubb3⁻Cd68⁺ TAM在转录水平上完全转变为Tubb3⁺ Cd68⁻神经元样细胞。这些发现提示了前所未知的“巨噬细胞向神经元样细胞转化”(MNT)现象，可能是一种以前未知的丰富的神经元样细胞来源，可直接促进肿瘤神经支配。

3. 为更好理解Tubb3⁺TAM亚群在肿瘤神经生成中的作用，作者在LLC同源基因肺癌模型的LysM-Cre/iDTR小鼠中进行巨噬细胞耗竭，发现Tubb3⁺ TAMs显著减少，通过体内的髓源性巨噬细胞（BMDM）过性转移能成功地逆转LLC肿瘤中的Tubb3⁺ TAMs。他们还发现体外LLC癌细胞条件培养基(CM)能刺激BMDM中的神经元形态；在TGF-β1刺激下发现BMDM出现成纤维细胞样形态。TGF-β1预处理可进一步增强癌细胞培养基诱导的BMDM神经元形态。与体外TGF-β1相比，CM刺激的BMDM中检测到更高表达的神经元分化介质(即Tubb3、NeuN和Pou4f1)，表明癌症条件是启动“巨噬细胞向神经元样细胞转化”(MNT)的关键因素。

对MNTs上调的差异表达基因进行无偏生物信息学分析，发现了与神经递质释放和受体表达相关的基因网络。巨噬细胞谱系scRNA-seq分析显示，突触前膜钙离子传感器(Syt13和Syt14)、神经递质合成酶(Aldh9a1和Dagla)和感觉神经元功能标记(TrkA和Prph)的表达在“巨噬细胞向神经元样细胞转化”(MNT)中高度富集，提示MNT在肿瘤感觉中可能发挥的潜在作用，可能导致癌症疼痛。

用经典的伤害性刺激辣椒素(一种TRPV蛋白的激动剂，TRPV蛋白负责响应癌症疼痛感)，通过OGB-1成像钙外流来表征MNTs的生物学功能，结果发现BMDM衍生的MNTs (Tubb3+ tdTomato+细胞)有钙流响应，而体外未受刺激的BMDM对照中没有检测到响应。BMDM来源的MNTs也对GSK1016790A(痛觉受体Trpv4激动剂)和KCl(神经元电压门控钙通道激动剂)的刺激有反应。（特定条件下的免疫细胞参与神经响应）

将体外产生的BMDM来源的MNTs过继转移到具有巨噬细胞功能障碍的非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中，MNTs的局部过继转移显著增加了NOD/SCID小鼠的癌症相关伤害感受反应。在人和小鼠MNT中均能检测到神经元钙信号(p-CREB和Camk2d)的激活；特别是在MNTs中检测到疼痛受体Ano1和Trpc1的特异性表达，以及在体内LLC肿瘤中表达突触素的MNTs与体外BMDM衍生的MNTs的神经回路形成的联系，证明了MNTs参与TME促进癌症疼痛。这些数据表明，MNTs在肿瘤中可能表现出伤害受体样活性，这可能是癌症疼痛的潜在治疗靶点。

4.共聚焦显微镜证实了人类NSCLC活检样本的MNTs中存在SMAD3的过度激活，另外Opal多重免疫组化染色证实巨噬细胞特异性Smad3与人类NSCLC中MNTs的丰富度之间的关系。因此，作者研究了在实验性肺癌模型中的Smad3依赖性TME在MNT中的调节作用。结果发现，在Smad3敲除(Smad3-KO小鼠)的LLC肿瘤TME中，不仅MNT而且肿瘤相关的伤害行为也被大幅度抑制，这意味着Smad3依赖性TME在MNT调控中起着至关重要的作用。

在体外实验中，Smad3缺失显著阻止了LLC癌细胞培养基诱导野生型BMDMs表达神经元标记物。作者通过将Smad3-野生型(WT)或Smad3-KO型BMDMs转入巨噬细胞功能障碍的NOD/SCID小鼠LLC肺癌模型中，发现过继转移野生型BMDM会显著增加MNT和癌症相关的伤害行为，而过继转移缺乏Smad3的BMDMs (KO-BMDM)则显著抑制了MNT，提示Smad3在MNT中的重要性。

使用特异性抑制剂SIS3对Smad3进行药物抑制可以有效地阻断“巨噬细胞向神经元样细胞转化”(MNT)及其相关的肿瘤神经分布(Tubb3⁺和NeuN⁺细胞)和LLC携带小鼠的癌症相关的自发伤害行为。因此，Smad3可能是靶向MNT驱动的癌症神经发生的药物靶点。