STAR Protocols | 荧光偏振技术：新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂高效筛选的全新方案

【字体：大中小】 时间：2022年10月12日 来源：安捷伦Biotek

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　　目前，新冠病毒奥密克戎变异株的全球蔓延导致了 COVID-19 确诊病例数量再度激增，其具有载毒量大、传播速度快、传播隐匿和降低疫苗保护力等特点，积极开发新型广谱抗冠状病毒药物刻不容缓。

进化保守的新冠病毒主蛋白酶（main protease, Mpro）在调控病毒 RNA 复制与转录过程中发挥了重要作用，且人体缺乏其同源蛋白酶，这使 Mpro 成为广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一。

目前已报道的 Mpro 小分子抑制剂筛选方法主要包括虚拟筛选法、荧光共振能量转移法、绿色荧光蛋白剪切互补法和表型筛选法等。但上述筛选方法普遍存在假阳性率高、筛选成本高、操作繁琐、稳定性差和筛选周期长等缺点，较大地限制了其在大规模高通量筛选中的应用。

2022 年 10 月 3 日，皖南医学院陈云雨副教授与美国佛罗里达州立大学医学院王彦昶教授合作在 Cell Press 旗下杂志 STAR Protocols 发表了题为《Protocol for high-throughput screening of SARS-CoV-2 main protease inhibitors using a robust fluorescence polarization assay》的实验方案论文（Protocol）。该论文详细描述了一个经过优化和验证的基于荧光偏振技术原理的 Mpro 小分子抑制剂高通量筛选方法，因其具有操作简便，灵敏可靠，经济廉价等优点，非常适合大规模的高通量筛选实验。

自 COVID-19 爆发以来，研究团队围绕新冠病毒主蛋白酶抑制剂高效筛选中的关键技术问题，首次建立了以荧光偏振高通量筛选模型为核心的系统性筛选与评价方法，并发现了若干天然产物来源的新型先导化合物，已在 Cell Biosci、Virology、Anal Biochem、《生物工程学报》和《药学学报》等杂志发表了多篇研究论文，并申请国家发明专利 2 件，助力了荧光偏振技术的发展。

文章中，在利用大肠杆菌原核表达技术制备高活性 Mpro 的基础上，研究者基于荧光偏振技术原理建立了 Mpro 小分子抑制剂高通量筛选模型。

在本筛选模型的设计中，以荧光探针 FITC-AVLQSGFRKK-Biotin 作为 Mpro 水解底物，活性化合物由于抑制 Mpro 对荧光探针的水解作用，故此荧光探针可与亲和素结合，分子量增大，旋转速度变慢，表现较高的 mP 值；非活性化合物由于不能抑制 Mpro 对荧光探针的水解作用，将切割荧光探针产生分子量较小的 FITC-AVLQ 片段，旋转速度加快，表现较低的 mP 值。研究者通过判断实验体系中 mP 值的变化即可快速筛选到苗头化合物。

在本实验方案中，研究者提供了详实的实验准备事项与操作要点，详细地阐述了高活性 Mpro 的制备方法及 Mpro 小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的使用流程。

本筛选模型使用时主要包括 4 步操作，且每轮筛选时间约为 1 h。其主要操作方法如下：首先，将 0.4 μM Mpro（29 μL/孔）与天然产物（1 mg/mL, 1 μL/孔）室温孵育 30 min。再加入 60 nM 荧光探针（20 μL/孔）进行 20 min 水解反应后，继续加入 0.3 μM 亲和素（10 μL/孔）孵育 5 min，终止其水解反应，最后以多功能酶标仪（Agilent BioTek Cytation5）检测其 mP 值并进行数据分析。

为了准确快速地筛选到苗头化合物，在每轮筛选中，每个筛选板中均应包括阳性对照孔（GC-376）、阴性对照孔（DMSO）和背景孔。由于本实验室资源所限，实验前期仅对本室小库容的天然产物化合物库进行了高通量筛选，发现了漆树酸（anacardic acid）对 Mpro 酶活性具有良好的竞争性抑制作用，其 IC50 值为 12.3±0.3 μM。

在本荧光偏振筛选模型中，底物的单孔使用量仅为 20 nM，且操作简便，每轮筛选时间仅为 1 h，展现了良好的稳定性、灵敏性和经济性。此外，由于荧光偏振检测中 FITC 的发射光为 535 nm，更好地避免了天然产物自身荧光对筛选模型可靠性的干扰。2021 年 7 月 1 日，针对本筛选方法的建立与应用，研究团队正式提交了国家发明专利申请，目前发明专利内容已正式公布（申请公布号：CN113699212A）。

综上所述

该实验方案系统地介绍了基于荧光偏振技术原理的 Mpro 小分子抑制剂高通量筛选模型的详细流程与实验方案，为抗新冠病毒药物的筛选与发现提供了全新技术手段。但在上述筛选模型中，由于荧光探针可以与亲和素形成具有较大位阻作用的四聚体复合物，可阻断 Mpro 对四聚体复合物中荧光探针的切割。因此，该实验方案必须独立分成 4 步操作完成，缺少了动力学检测特点，还需要结合荧光共振能量转移方法进行苗头化合物的抑制机制研究，具体的实验优化与改进方法仍有待进一步研究。

北京协和医学院医药生物技术研究所张晶副研究员、皖南医学院药理学硕士生闫浩浩和闫干干为论文的共同第一作者，王彦昶教授和陈云雨副教授为论文的共同通讯作者。

我们非常高兴看到陈云雨副教授团队使用安捷伦BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统的荧光偏振功能开发了新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂高效筛选的全新方案，BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统除了具备酶标仪的全部功能以外，还可以实现细胞培养和成像分析，其良好的环境控制体系（温度、氧气和二氧化碳控制装置）无需额外使用二氧化碳培养箱即可实现长达168小时的连续或非连续动力学实验。

未来，我们也期待Cytation 5 可以帮助陈云雨副教授团队实现基于动力学检测的高通量筛选技术的开发。

您可以通过下方相关阅读查看陈云雨副教授在学者论坛上对该技术的解读。