体验WorkBeads 40Q在寡核苷酸纯化中的优异表现

【字体: 时间:2022年10月13日 来源:基因有限公司

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  本文我们会分享WorkBeads 40Q阴离子交换纯化填料在两种寡核苷酸纯化中的优异表现。

火热的核酸药物!

据弗若斯特沙利文正式发布《核酸药物市场产业现状与未来发展研究报告》指出,核酸药物主要包括mRNA和寡核酸两类,目前全球已有数十款核酸药物上市。短期来看,mRNA产品的未来市场主要贡献者仍然将是新冠疫苗;针对患者群体较大适应症的寡核酸药物,则将驱动市场快速发展。

寡核苷酸药物(oligonucleotides, ONs)是由人工化学合成的12~30个寡核苷酸单链或双链组成的一类药物,通过碱基配对原则作用于目标信使 RNA(mRNA),主要分为反义寡核苷酸药物 (antisense oligonucleotides, ASOs) 、小干扰RNA 药物(small interference RNA, siRNA)、和核酸适配体(Aptamer)等。寡核酸药物是与小分子药物、抗体药物完全不同的全新药物类别,能够直接调控基因表达,被认为是继小分子药物和蛋白质类药物之后的新一类药物开发热点方向。

寡核苷酸纯化

固相合成生产的寡核苷酸制剂的纯度可以达到比较高的水平,然而对于其的应用领域,特别是用作治疗用途的寡核苷酸,我们依然需要利用纯化来去除其中不完整或是错误的序列。在合成的寡核苷酸中,总是存在小部分的错误序列,包括碱基的缺失或插入(例如,N-1或N+1,N指靶寡核苷酸的长度)。错误序列的频率会随着合成寡核苷酸的长度而增加,因此错误序列在产物中所占的比例会随靶核苷酸的长度增加而明显增大。通常来说N-1的错误序列较难从全长的靶寡核苷酸中分离出来,因为其与靶核苷酸的长度和带电量最为接近。常见的纯化策略包括有疏水层析/反相层析(如果保护基团DMTr未去除)和阴离子交换层析。阴离子交换色谱(AIEX)是一种有效的寡核苷酸纯化技术,可在单个步骤中获得高纯度和高收率。

阴离子交换层析

因为寡核苷酸的长度与其所携带的负电荷量呈正相关,因此阴离子交换层析可以根据长寡核苷酸所携带的负电荷量的不同来分离不同长度的寡核苷酸,是常用的寡核苷酸纯化方法。核酸骨架中带负电荷的磷酸基团与AIEX填料上带正电荷的配体基团结合,通常来说结合强度随核苷酸分子长度的增加而增加。可以通过逐渐增加盐浓度梯度将不同长度的寡核苷酸依次洗脱出来,从而达到分离和纯化的目的。

WorkBeads 40Q

WorkBeads琼脂糖纯化填料使用特有的方法生产,使其填料基球具有优化的内部孔隙结构和出色刚性结构以承载高流速,可良好地应用于核酸,蛋白质,多肽和病毒等生物分子的纯化。WorkBeads 40Q是一种高载量的强阴离子交换填料,40微米的基球兼具了高分辨率和易扩大生产的性能,且非常适合纯化寡核苷酸,可提供高纯度和高收率。

本文我们会分享WorkBeads 40Q阴离子交换纯化填料在两种寡核苷酸纯化中的优异表现。

纯化实例1:20聚体的纯化

小上样量的筛选实验:20聚体的纯化初体验

使用WorkBeads 40Q 针对1 mg (上样量为填料动态结合载量的0.06%) 20聚体寡核苷酸在变性和非变性条件下进行初步的纯化,洗脱产物以1mL的体积单位进行收集后,对产物纯度进行检测。上图是在两种缓冲液体系下(A使目标序列不变性; B使目标序列变性) 使用WorkBeads 40Q进行纯化的色谱图,红色虚线是条件A,蓝色实线是条件B,绿色虚线是条件A的洗脱条件,绿色实线是条件B的洗脱条件。

上图黄色柱状图显示正确长度的目标序列在A2-A8洗脱产物中的得率分布,蓝色柱状图显示在A2-A8洗脱产物的纯度分布,柱状图上方的深蓝色数字是N-1的错误序列在A2-A8中的含量百分比。如图可见在收集的洗脱峰的中部目标序列的纯度和得率达到最高。

与竞品的性能对比

上面图表显示了在测试两种纯化条件下纯化20聚体,与Capto Q ImpRes 相比,WorkBeads 40Q纯化的产物纯度和得率表现更佳。

大上样量的仿扩大化生产纯化

在工艺级别的纯化中,目标通常是最大限度地提高产量的同时达到预定的纯度要求。 因此在达到纯度要求的前提下,可收集的洗脱峰范围越大则牺牲产品的产量越少。为了研究扩大纯化条件,将132 mg上述20聚体寡核苷酸制剂上样到WorkBeads 40Q柱中(上样量为填料动态结合载量的80%)。

上图是WorkBeads 40Q对于132mg 20具体寡核苷酸的纯化色谱图,蓝色实线代表了280吸光度,绿色实线代表洗脱梯度,橘色实线代表了寡核苷酸的浓度。

上图是洗脱峰,每个组分洗脱液为1ml,蓝色柱状图显示了在收集的洗脱峰中各个洗脱组分的纯度。

在盐浓度洗脱梯度开始时,N-x 的错误序列杂质被洗脱,全长的寡核苷酸在洗脱峰梯度的后期纯度和得率达到最高。

从表中可以看到,在将洗脱液汇集从55 ml 到35 ml,全长寡核苷酸的纯度略有下降,而得率显著提升,在大上样量的情况下,WorkBeads 40Q对此20聚体依然有良好的纯化表现。

对于此20聚体,单独使用WorkBeads 40Q纯化此固相制备寡核苷酸可以将样品纯度从85%提升到95%,且大上样量也同样适用。

纯化实例2:45 nt RNA合成后纯化对比

针对12.5 mg合成的纯度为79.5%的45 nt RNA粗提物,使用三种阴离子交换填料进行动态结合载量的测试对比,其中WorkBeads 40Q和Capto Q ImpRes具有40微米的基球直径,TSKgel SuperQ-5PW是20微米的基球直径。纯化条件是20 mM 磷酸钠缓冲液, 7%乙腈, pH 7温度50°C,样品保留时间为2.5分钟,WorkBeads 40Q对纯化此RNA可达到 56.4 mg/mL填料的动态结合载量,高于另外两个同类型竞品30%以上。

WorkBeads 40Q在寡核苷酸纯化方面的优异表现与WorkBeads基球优化的内部孔隙结构是分不开的,更小的基球内部孔径给寡核苷酸分子提供了更多的与填料互相作用的机会,体现出更高的动态结合载量,同时优化的孔隙分布可帮助客户达到更高的纯化产物纯度。40微米的基球更是兼具了高分辨率和易扩大生产的性能。

本文案例中使用的 WorkBeads 纯化填料出自与基因有限公司独家合作的 Bio-Works 品牌。Bio-Works 专注于设计开发,生产和供应用于分离纯化抗体,蛋白质,多肽,寡核苷酸,病毒和其他生物分子的纯化填料,产品可用于生命科学与生物制药的开发与制造。其短链交联的生产方式可获得尺寸一致的刚性琼脂糖树脂填料 WorkBeadsTM,优化的孔隙结构可带来产量和纯度的良好组合,具有高分辨率和易放大生产的良好性能。

如果您正在从事核酸,抗体,蛋白质/多肽,核酸,病毒/疫苗等生物大分子的纯化,欢迎您联系我们申请免费试用装。

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