用简化的无Langendorff法分离小鼠成年心肌细胞(54)来自wt和客户4?/?老鼠。简单地说，老鼠被麻醉，打开胸腔露出心脏。切断降主动脉，然后注射7 ml EDTA缓冲液[130 mM NaCl，5 mM KCl，0.5 mM NaH2人事军官410 mM Hepes，10 mM葡萄糖，10 mM丁二酮肟（BDM），10 mM牛磺酸和5 mM EDTA（pH7.8）]进入右心室。夹闭升主动脉，将心脏转移到含有EDTA缓冲液的培养皿中。左心室注射10ml EDTA缓冲液，然后注入3ml灌注缓冲液[130mmnacl，5mmkcl，0.5mmNaH2人事军官4，10 mM Hepes，10 mM葡萄糖，10 mM BDM，10 mM牛磺酸和1 mM MgCl2（pH7.8）]，30 ml胶原酶溶液[胶原酶2（0.5 mg/ml）、胶原酶4（0.5 mg/ml）和在灌注缓冲液中制备的蛋白酶XIV（0.05 mg/ml）]。心腔被分开，轻轻地拉成1毫米的碎片。用温和研磨法分离细胞，用5ml停止缓冲液[含5%（v/v）无菌FBS的灌注缓冲液]抑制胶原酶活性。用灌流缓冲液冲洗细胞三次，使其在重力作用下沉降。然后在4℃下用200 nM有丝分裂跟踪器加载心肌细胞1小时。然后将携带有丝分裂追踪器的心肌细胞分散在多聚体上-我-赖氨酸处理盖玻片1小时，并进行免疫细胞化学处理。
小鼠新生心肌细胞
如前所述，分离出MNCMs(19,55)来自wt和客户4?/?老鼠。简单地说，从wt小鼠的p3幼崽中手术切除心脏，并将其置于分离缓冲液中[16mmnacl，20mmhepes，0.8mmna2HPO公司4，5.4 mM葡萄糖，5.4 mM KCl和0.8 mM MgSO4（pH7.35）]。心室在分离缓冲液中粉碎，然后在1000℃离心g在4°C下保持5分钟。将组织块重新悬浮在含有0.25%胰蛋白酶的分离缓冲液中，并在37℃下在水浴摇床中培养20分钟以进行消化。20分钟后，细胞被旋转下来（1000g，5min，4°C），通过细胞过滤器（100μm）收集上清液中分离的乳鼠心肌细胞，并立即用20%（v/v）马血清富集。将剩余的组织颗粒消化至少两次或直到观察到清晰的组织颗粒。然后将分离的心肌细胞接种于明胶[0.1%（w/v）]–包被的盖玻片上，并在含有20%（v/v）FBS和青霉素（100 IU）/链霉素（100μg/ml）的DMEM中培养，在5%（v/v）的湿化CO中培养2培养箱温度37℃，培养2天后更换培养基。分离第4天后，在37℃下用200nm有丝分裂跟踪器加载MNCMs 10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，并进行免疫标记。
粗线粒体
重量,clic1?/?，和客户4?/?分离小鼠（12至15周）的心脏，并将其细碎并均匀化于分离缓冲液A【70 mM蔗糖、210 mM甘露醇、10 mM EDTA Na2，和50 mM tris HCl（pH 7.4）]，使用波特-埃尔维耶姆均质机（七冲程）。匀浆于1300时离心g在4°C下保持5分钟。将上清液转移到新鲜的Eppendorf试管中，并在10000下离心g在4°C下保持10分钟。将含有粗线粒体的颗粒重新悬浮在含有200 nM有丝分裂跟踪器的隔离缓冲液A中，并在4℃下培养1小时。有丝分裂跟踪器的线粒体分布在一个多聚体上-我-赖氨酸处理的盖玻片在4°C下处理1小时。然后处理线粒体进行免疫标记。
超纯线粒体的分离
如前所述，分离超纯线粒体组分(11).简单地说，小鼠心脏（12至15周）在隔离缓冲液a（70 mM蔗糖，210 mM甘露醇，10 mM EDTA Na）中均质后2，在1300下离心50 mM tris-HCl（pH 7.4）]g在4°C下保持5分钟。上清液在10000时再次离心g在4°C下保持10分钟。将含有粗线粒体的颗粒重新悬浮在55μl的分离缓冲液A中。将重新悬浮的粗线粒体制剂覆盖在缓冲液B（250 mM蔗糖、10 mM Hepes Na和1 mM EDTA Na）中制备的3 ml 30%（v/v）Percoll上2（pH值7.4）]。样品在50000下离心g在4°C下保持45分钟。超速离心后，获得三个透明层，分别标记为M1、M2和M3，其中M3是超纯线粒体部分。仔细分离M1、M2和M3层，在1mL缓冲液A中重新悬浮，并在12000下离心g在4°C下保持10分钟（三次）。在放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液中重新悬浮颗粒[50 mM tris HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA Na21毫米4，1%（v/v）NP-40，0.5%（w/v）脱氧胆酸钠，0.1%（w/v）十二烷基硫酸钠，1 mM NaF，1 mM苯甲基磺酰氟和1 mM Na三旁白4（pH7.4）含有蛋白酶抑制剂（1片/50 ml，罗氏）和磷酸酶抑制剂（1片/10 ml，罗氏）]，在液氮中冷冻，并处理用于蛋白质印迹分析。
MAMs和线粒体的分离
MAM组分被分离出来，正如之前发表的那样(10,56).简单地说，使用波特-埃尔维耶姆均质机（8次冲程）将小鼠心脏（12至15周）分离、粉碎并均匀化于IB-H1缓冲液中（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、0.5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）、0.5 mM EGTA和30 mM tris-HCl（pH 7.4）]。匀浆在740℃离心两次g在4°C下各5分钟。收集上清液并在9000时再次离心g在4°C下保持10分钟。去除上清液（细胞溶胶），并在冰缓冲液IB-H2（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、0.5%（w/v）BSA和30 mM tris-HCl（pH 7.4））中轻轻再悬浮，并在10000下离心g在4°C下保持10分钟。去除上清液，将颗粒重新悬浮在缓冲液IB-H3中【225 mM甘露醇、75 mM蔗糖和30 mM tris HCl（pH 7.4）】，并在10000下再次离心g在4°C下保持10分钟。将含有粗线粒体的颗粒重新悬浮在55μl的线粒体再悬浮缓冲液（MRB）[250mm甘露醇，0.mm5egta，5mmhepes（ph7.4）]。将粗线粒体颗粒覆盖在3 ml 30%（v/v）Percoll培养基中制备的Percoll[225 mM甘露醇、1 mM EGTA和25 mM Hepes（ph7.4）]，并在95000下离心g在4°C下保持30分钟。这一步将MAM（上带）和线粒体（下带）分开。收集含有线粒体的下带，在MRB缓冲液中重新悬浮，并在10000℃离心g在4°C下保持10分钟。离心后得到的小球在RIPA缓冲液中再悬浮并在液氮中冷冻。在MRB缓冲液中稀释含有MAM的上带，并在10000下进一步离心g在4°C下保持10分钟。收集上清液并在100000下离心g在4°C下保持1.5小时。收集MAM颗粒，在RIPA缓冲液中重新悬浮，并在液氮中冷冻。所有细胞组分包括粗心脏裂解物、胞浆、粗线粒体、纯化线粒体和MAM组分，经过三次反复的冻融循环，并进行westernblot分析。
在玻璃盖玻片上感染了mtRCamp1h病毒(16).48～72小时后，感染的MNCMs在室温下用Fluo-3am（Invitrogen）在含有2mmca的Tyrode's溶液中放置10min二+，然后在含有2 mM Ca的Tyrode's溶液中清洗10分钟二+心肌细胞灌流含有2 mM Ca的Tyrode's溶液二+在RT录制期间。用543nm的HeNe激光激发生物传感器mtRCamp1h，在560-660nm波长处收集荧光发射，在488nm激发Fluo-3am，在500-530nm波长收集荧光发射。咖啡因在10mm处诱导RyR2介导的Ca二+释放。加利福尼亚州二+瞬态振幅表示为ΔF/F0，其中F0是基本荧光和ΔF=F?F0.
加利福尼亚州二+成年小鼠心肌细胞的影像学研究
胞浆Ca的共焦成像二+如前所述(17)简而言之，新鲜成年小鼠心肌细胞(54)在室温下将Fluo-3am（Invitrogen）装入含有1mm Ca的Tyrode溶液中10min二+，然后在含有2 mM Ca的Tyrode's溶液中清洗10分钟二+心肌细胞灌流含有2 mM Ca的Tyrode's溶液二+在RT录制期间。Fluo-3am在488nm激发，荧光发射在500-530nm波长，在200hz的线扫描模式下收集。心肌细胞的起搏频率为0.5hz。β肾上腺素能激动剂ISO在100nm处使用。实验结束时，咖啡因在10毫米处被用于评估SR-Ca二+内容。胞质钙二+瞬态振幅和咖啡因瞬态振幅表示为ΔF/F0，其中F0是基本荧光和ΔF=F?F0SERCa2a率是通过拟合咖啡因诱导的钙的单指数来计算的二+瞬时的，然后用双组分指数拟合胞浆Ca二+具有固定第一τ的瞬态。
Wt CD1和客户4?/?如前所述，从室内饲养获得的小鼠（12至15周）进行Langendorff灌流(12).简单地说，从老鼠身上切下心脏，并将其置于冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）（118 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM KH）中2人事军官4，1.2毫米MgSO425毫米NaHCO三11.1毫米d-葡萄糖和2 mM CaCl2).主动脉插管，心脏在Langendorff装置上逆行灌注，KHB以95%O起泡2–5%一氧化碳2心脏灌注15分钟，然后缺血25分钟，在37°C下再灌注2小时。对于假对照组，心脏在37℃持续灌注160分钟。在某些情况下，心脏在再灌注前用DMSO（载体对照）或IAA-94（50μM）后处理10分钟。为了评估大肠癌，心脏缺血25分钟，再灌注20分钟。再灌注后，对心脏进行处理以评估线粒体大肠癌或用TTC染色以评估梗死面积。
在MAM和超纯线粒体制备过程中获得的不同细胞组分在RIPA缓冲液中重新悬浮，在4℃下连续振荡培养1小时。来自wt和客户4?/?将IR损伤后边缘区的小鼠或心脏切片在RIPA缓冲液中粉碎，匀浆制备心脏裂解液。在液氮中快速冷冻裂解物，一旦解冻，在4℃下培养，并持续摇晃1小时。1小时后，样品在12000下离心g在4℃下20 min，收集上清液并将其加载到4至20%（w/v）的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并转移到硝化纤维素膜上。蛋白质载量用胭脂红S染色证实。用LI-COR封闭缓冲液封闭膜，并用tris缓冲盐水（TBS）冲洗，然后在4°C下与各种主要抗体孵育过夜。使用的主要抗体有GRP78/BIP（ab21685）、CLIC4（sc-135739）、CLIC1（sc-374202）、三磷酸腺苷（ATP）合酶（ab14748）、MCU（14997）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（2118）、丝裂霉素2（ab-205236）、ACSL4（PA5-27137）、抑制素（ab-10198）、细胞色素c（pa1-12250）和亲环素D（AP1035）。在用TTBS（含有0.05%吐温-20的20 mM Tris缓冲液盐水）洗涤三次10分钟后，在室温下用与IR680/IR800结合的抗兔/小鼠次级抗体培养1小时，然后用TTBS再次洗涤3次5分钟。使用红外荧光系统（Bio-Rad）观察信号。利用ImageJ对条带的强度进行量化，并利用不同亚细胞组分的丽春红S信号将其归一化为负载蛋白。在某些情况下，蛋白质量标准化为相应的GAPDH对照。
来自wt和客户4?/?小鼠在PBS中洗涤，切碎，并在缓冲液A（70 mM蔗糖、210 mM甘露醇、1 mM EDTA和50 mM tris HCl（pH 7.4））中使用Potter-Elvehjem均质器（七次冲程）使其均质。匀浆在2500下离心g5分钟。收集上清液并在12000下离心g将含有粗线粒体的颗粒再悬浮于55μl缓冲液B中[70 mM蔗糖、210 mM甘露醇、0.1 mM EDTA和50 mM tris HCl（pH 7.4）]。用荧光分光光度计（日立F-2710或Hitachi F-7100）检测线粒体外钙。在存在或不存在CsA的情况下，将钙绿-5N，六钾盐（2.5μM）（Thermo Fisher Scientific，从500μM储备中提取10μl）添加到CRC缓冲液中[150 mM蔗糖，50 mM KCl，2 mM KH2人事军官4，5 mM琥珀酸和20 mM tris-HCl（pH 7.4）]，并测量荧光（500 nm激发和530 nm发射）。30s后，加入50μl分离的线粒体样品。再过90秒，此后每隔60秒，5μM CaCl2脉冲被加入，直到荧光快速增加表明线粒体死亡。根据制造商的说明，使用Bio-Rad试剂盒对线粒体进行蛋白质估算。荧光值根据蛋白质浓度标准化，并比较不同实验组诱导线粒体死亡所需的钙。
如前所述，冷冻人心脏组织被亚组分(32).简单地说，150 mg组织在细胞溶解缓冲液（CLB）缓冲液中均匀化[10 mM Hepes，10 mM NaCl，1 mM KH2人事军官45毫米NaHCO三，5毫米EDTA，1毫米氯化钙20.5毫米氯化镁2（pH7.5）和完全蛋白酶抑制剂片]，并且通过添加100μl 2.5 M蔗糖来恢复等渗性。匀浆在6300离心g在4°C下保持10分钟。将上清液转移到新鲜管（sup1）中，将颗粒重新悬浮在500μl CLB/0.25 M蔗糖中，并在6300重新离心g在4°C下保持5分钟。将上清液（sup2）与之前的上清液样品（sup1）混合，并将颗粒重新悬浮在1 ml TSE缓冲液中【10 mM tris、300 mM蔗糖、1 mM EDTA和0.1%（v/v）NP-40（pH 7.5）】中并均质化（30次冲程）。样品在4000℃离心g在4°C下保持5分钟。用TSE缓冲液均质后得到的最终颗粒再悬浮在RIPA缓冲液中，代表浓缩的核部分。混合上清液（sup1和sup2）在107000下离心g在贝克曼超离心机中，在4°C下保持30分钟。离心步骤后获得的上清液代表细胞溶质分数。超速离心后得到的颗粒再悬浮在RIPA缓冲液中，代表膜和细胞器部分。对裂解物进行Western blotting处理，并用抗CLIC1和抗CLIC4抗体进行探测。CLIC4和CLIC1的表达标准化为通过丽春红S染色检测的总蛋白含量，使用ImageJ软件分析定量条带强度。
