五大技巧帮助您应对单细胞组织解离

【字体: 时间:2022年10月26日 来源:10x Genomics

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  作为一名已经历这一过程并找到行之有效方法的科学家,康奈尔大学的Madhav Mantri为许多有意开展单细胞实验的科学家提供了许多有价值的建议。

单细胞组织解离并不是一个广泛适用的过程。单细胞实验的组织解离可能很困难,需要不断练习和优化才能获得最佳结果,具体取决于组织类型、物种、样本年限、处理环境及其他因素。不过科学发现的可能性非常值得我们付出努力,而且在这个过程中也会有人相助。

作为一名已经历这一过程并找到行之有效方法的科学家,他为许多有意开展单细胞实验的科学家提供了许多有价值的建议。阅读本文,您可以了解困难的单细胞组织解离的技巧,并通过观看网络研讨会的回放视频(扫描文末二维码)或阅读研究团队的预印本文章,了解方法上的更多细节。

技巧1:练习、练习,再练习

在聚焦免疫学网络研讨会上,Mantri首先介绍了如何不断练习并在真实实验中取得成功的经验,也就是真正使用珍贵的样本和试剂时。


网络研讨会的屏幕截图,我们特邀了康奈尔大学的博士生Madhav Mantri。

Mantri的研究重点是病毒性心肌炎,即感染引起的心脏炎症。他使用呼肠孤病毒1型(Lang毒株)感染的新生小鼠模型,并在感染过程中的多个时间点切除了小鼠幼崽的心脏和回肠组织。

“我必须先用对照(mock)小鼠进行多次练习,而不是用我准备使用的病毒感染小鼠,因为我不想把所有精力都放在用口服灌胃法感染这些新生幼崽上,然后又不用这些组织开展实验。因此我用年龄相同的对照幼崽进行练习,它们的组织大小几乎相同。”

除了用来自模式生物且年龄和组织相匹配的样本进行练习之外,对于在处理珍贵的人体样本时如何找到相当的练习组织,Mantri也给出了建议。这堪称生物学研究的“第22条军规”(形容进退两难):尽管在使用珍贵的人体样本之前必须进行练习,但由于您拥有的样本量有限,即使能也很难真正找到人体练习组织(因为它们很珍贵)。

Mantri建议从科学文献入手,首先根据供体或患者的年龄确定您想要处理的组织中的细胞外基质(ECM)成分,因为这将严重影响组织解离方案。在此基础上,他建议使用年龄相当的小鼠组织进行练习:“看看哪个年龄段的小鼠有相同的ECM成分,再使用该组织来练习解离。”

此外,Mantri还提供了一个他在准备实验时经常使用的工具——10x Genomics文献页面,这是一份使用10x Genomics技术的同行评审文献目录,可根据组织类型、物种和其他字段进行过滤。它提供了一份文献目录,供您在搜索与待用样本相匹配的方法时查看。(当然,您也可以随时联系10x Genomics的支持团队寻求帮助!)

技巧2:使用组织采集和处理的最佳做法

Mantri给我们介绍了他的实验,从组织采集到放入Eppendorf管,并记下了样本处理的最佳做法。首先,由于他使用的是新鲜冷冻的单细胞RNA-seq试剂盒,他很早就规划了他的实验,而且很注意新鲜组织对环境需求以优化细胞活力。他将重点放在心脏组织上,并表示:

“我在获得心脏组织后将它放入装有冰冷HBSS溶液的培养皿上。之后我会灌注心脏,并确保尽可能去除腔室中的血液。我再把组织转移到一块新的培养皿上,并把它切成1毫米见方的小块。在整个过程中,组织都必须保持冰冷的温度,处于冰冷的洗涤缓冲液中,而且任何时候都不应该达到室温。”

Mantri分享了更多细节:“这一切都是在塑料培养皿上做的,而培养皿是放在巨大的冰桶上的。”

“我在一个培养皿中清洗了心脏组织,然后用镊子把它夹起并放入新鲜的溶液中。现在洗涤部分已经完成,于是我开始切碎组织。我会去除大部分HBSS,让组织处于半干状态。我不会将它浸泡在大量液体中,而是在培养皿的角落中保留一点HBSS溶液,将我的组织放在那里,然后用刀片把它切碎。之后我会用移液管将组织和溶液一起吸进去,并转移到Eppendorf管中。这就是我为什么不[在培养皿中]使用大量溶液的原因,因为我在开始酶促解离方案之前要用台式离心机来洗涤切碎的组织。” 

正如Mantri强调的那样,实践对于样本采集和处理也是很重要的,因为某些组织比其他组织更难在离体条件下保持良好的组织质量。例如,一旦动物被处死,肠道回肠组织就会开始消化,因此必须动作迅速,将它放入冰冷的溶液中。在某些情况下,若组织比较坚硬(如心脏),当它们仍处于动物体内时灌注工作会比较容易。

技巧3:根据细胞类型和组织来定制酶混合物和反应时间

酶促解离是从切碎的组织中释放单细胞的下一个关键步骤。根据Mantri的说法,酶促组织解离有一个“最佳点”:“解离组织的时间不能太长,因为这会影响细胞活力。但也不能添加过多的酶来加快解离,因为酶促反应在对组织不利的条件下也会发生。”

时间序列实验可以帮助您确定在某个定时反应中多少酶才是适量的:

“对比较短的时间,应使用较高浓度的酶;而对较长的时间,应使用较低浓度的酶。您可以制作一张包含酶浓度和时间进程的表格。将组织放在不同的管内并进行这些反应,最后通过细胞计数来确定存活率。对于心脏组织,我一开始就这么做了,因此我知道至少需要30分钟的解离。”

Mantri强调说,找到解离的最佳点需要特别注意组织的细胞组成。

“解离是一个依赖于细胞类型的过程。细胞类型不同,对应激的耐受程度也不同。例如,肌细胞是心脏特有的细胞类型,必须很小心地处理,否则就无法获得很高的产量。优化肌细胞和平滑肌细胞的解离非常重要,因为它们很快就会死亡。”

在确定哪种酶和浓度适合特定的样本及其包含的细胞时,目前有许多资源可以指导您。Mantri使用了Worthington Biochemical公司提供的数据库并向其他人强烈推荐,该数据库为酶促解离心脏组织提供了许多具体建议。此外,Mantri建议,如果您想研究样本中的特定细胞类型,比如干细胞,使用市售的试剂盒来分离感兴趣的细胞类型会更有效率。

然而,当相同组织的酶解需求发生冲突时,组织解离会变得更加复杂。例如,Mantri发现,回肠组织比最初预计的更加复杂:“肠道和绒毛由完全不同的细胞类型组成”,这会影响酶促反应的效率。此外,肠道组织本身不耐受Mantri对其他组织所用的基本试剂中的某些成分,即PBS和HBSS。“我们用来破坏[肠道中]成纤维细胞基质的解离酶不应含有[胰蛋白酶-EDTA]。但它能非常快速地从肠道中解离绒毛。”在这种情况下,EDTA是一把双刃剑:它能完美地解离绒毛,但会通过中和溶液中的钙离子和镁离子而抑制胶原酶的活性,胶原酶是Mantri想要用来解离肠壁组织的酶,而两种离子是其发挥作用所必需的。

Mantri介绍了一种解离方案,能够分别解离肠道和绒毛:

“解离肠壁组织需要一个多小时。不过我分两步完成,采用EDTA分离出绒毛上皮细胞,将它们放在冰上,然后取出剩下的肠壁组织块,将其转移到一个新管内,彻底洗涤以去除EDTA。之后我添加了胶原酶并补充了氯化钙,我发现它可以在20分钟内完成(解离)。”

这些创新的改动是反复试验的结果,甚至是Mantri的一些失败实验。然而,这些经验教训对于他以及其他人未来的实验来说是无价的。“有时,同一种组织的解离可能会面临相互冲突的试剂要求,因此在开始下一个反应之前,你必须小心洗掉那些可能以任何方式限制酶促反应的物质。”

技巧4:考虑连续酶解

Mantri提供的另一个可加速解离过程并确保最佳细胞活力的技巧是一种称为连续解离的方法。“连续解离是一种非常有效的可加速解离的方法,但不是通过增加酶浓度,”Mantri解释说,他从装在2 mL Eppendorf管中的切碎组织开始,在热循环仪上以很低的速度混合。他详细描述了这个过程。

“在30分钟的解离方案中,每10分钟(3次)我会将试管短暂离心或让它沉降,将它从热循环仪中取出并稳定放置在工作台上。等大块组织沉淀下来,我会吸出悬浮液,将其转移至冰上的新管子中。如果有些细胞已经离开组织进入溶液中,我不希望它们在不适合的条件下继续待30或40分钟[在解离方案的剩余时间内]。我希望它们转移到合适的4℃环境。因此我会准备一个更大的管子,里面装了很多合适的溶液,基本上是PBS + BSA,你可以在其中重悬细胞。然后,我会用新鲜的酶来取代用过的酶,以加快整个解离方案。如果你在30分钟内不换酶,那么酶活在解离过程中是不同的。如果每10分钟换一次,总共3次,则会加速下一轮的解离。解离过程会变得更高效,而且你已经取出了悬浮细胞,并将它们放在PBS + BSA的合适溶液中。”

技巧5:去除红细胞,宜早不宜晚

在单细胞悬液形成后,将细胞上样到Chromium仪器之前,仍有几个关键的必备步骤。洗涤细胞悬液,去除不想要的细胞或碎片,特别是组织中残留的红细胞,这一点很重要。Mantri分享了他为获得纯净的细胞悬液所做的工作:

“我通常使用红细胞裂解液(ACK裂解液)来去除红细胞。我要强调的一件事情是,如果您要进行3到4次洗涤,那么请尽早裂解红细胞。当红细胞裂解时,它们会将其RNA释放到溶液中。如果此时用的不是50 mL管,而是15 mL管,那么就会使从溶液中洗掉游离RNA的效果大不相同。如果洗得不干净,溶液中存在游离RNA,然后将其上样到Chromium仪器中,那么这些RNA分子将进入微滴并带上条形码,而您的数据中到处都有背景。”

Mantri强调,即使在组织解离开始之前,也必须勤于开展洗涤步骤,以确保在这些阶段尽可能多地去除不想要的细胞,就像红细胞裂解那一步一样。

我们非常感谢演讲者Madhav Mantri分享了这些有用的信息,这些信息是从他开展单细胞实验的亲身经历中获得的。如果您想了解更多信息,请扫描下方二维码观看聚焦免疫学网络研讨会的回放视频。

 

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