这碗“生物墨水”能不能用,谁说的算?

【字体: 时间:2022年10月26日 来源:安捷伦Biotek

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  Agilent-BioTek 的微孔板成像技术,不仅能助力生物 3D 打印技术生物墨水的开发,其多模式成像与检测分析方法也能为生物3D打印提供多维度的质控和功能性研究,满足研究者的各类检测需求。

随着科技的发展,3D 打印技术对于人们来说已经不再陌生。

而生物 3D 打印,作为3D 打印技术的分支,业已帮助研究者克服了很多医学难题,因此生物 3D 打印作为新兴交叉前沿技术,近年来在国内外受到前所未有的关注。

什么是生物 3D 打印技术?

简单来说,生物 3D 打印技术是利用活细胞、生物活性因子及生物材料设计制造出具有生物活性的人工器官、植入物或细胞三维结构的技术,融合了制造科学与生物医学等不同学科。


图一:3D 打印技术 VS 生物 3D 打印技术

在生物 3D 打印过程中,活细胞通常被封装在“生物墨水”中,通过控制打印参数模拟出活体组织,所以生物 3D 打印首先需要研究的是生物墨水。

目前尚不存在理想型的生物墨水。

天然生物材料的墨水具有良好的生物相容性,但是大多难以打印或者力学性能不好,而人工合成高分子材料的墨水打印性能或力学性能较好,但生物活性一般较差。因此,研究出打印性能好且具有良好生物兼容性的生物墨水是生物打印行业的必行之路。

那么3D 生物墨水好不好,能不能用,需要从以下几个方面进行鉴定和评估。

一 3D 打印支架对活细胞的损伤程度

首先,生物墨水必须提供生物活性、细胞附着位点,允许细胞存活、附着和增殖。例如在生物 3D 打印支架 15d 后,通过细胞成像方式测定支架细胞活力,用于评价打印支架对活细胞的损伤程度。结果显示所检测的三种细胞系 BxPC3 、HEK-293 、前列腺癌干细胞在4% (w/v) Alginate-4% (w/v) CMC 材料中均表现出良好的细胞活力, 这一现象表明该种材料对活细胞损伤较小。


图二:(a)4% (w/v) Alginate-4% (w/v) CMC 材料中细胞存活率 (b)各类细胞系的细胞活力

二 生物墨水的生物兼容性

在挤出式生物3D打印中,生物材料必须具有生物相容性,且对细胞无毒。生物墨水的生物兼容性可以通过微孔板成像技术间接量化生物打印后细胞的死/活来进行评估。

例如,将 HEK-293 和 BxPC3 细胞系分别加入研发的生物墨水中,然后在打印 15d 后通过荧光标记和明场成像进行细胞形态学观察。


图三:HEK293 细胞形态

(a)海藻酸-CMC 细胞装载(b)海藻酸细胞装载
(Ⅰ)相差(Ⅱ)GFP (Ⅲ)相差与
GFP 通道 merge(Ⅳ)细胞形态

结果如图三,HEK-293 细胞与生物墨水发生结合,表明该生物材料有利于 HEK-293 细胞的附着,具有一定的生物兼容性,而 BxPC3 细胞在 15d 培养后形态上并未发生变化。

三 挤压压力对细胞存活率的影响

已有研究表明:流体速度会在打印喷嘴的中心逐渐增加,而剪切速率和相应的剪切应力向中心减小,在喷嘴壁处最大。为了研究挤压压力及其空间分布的影响,分别在压力为 8psi 和 12psi 打印 HEK-293 细胞。结果表明细胞在喷嘴壁处会遭受到更大的剪切应力,因此在沉积丝的截面上,壁附近的细胞活力较低。


图四:沉积丝中的细胞死/活分布

图四中展示了在沉积丝壁的边缘有更多的死细胞,活细胞的数量向沉积丝的中心增加,这一结果,通过观察沉积丝在 8psi 和 12psi 下的细丝截面也能看到这一现象。


图五:在 8psi 下沉积丝横截面活/死细胞的比较


图六:在 12psi 下沉积丝横截面活/死细胞的比较

图五和图六分别展示了在不同压力下沉积丝横截面的死活细胞分布,将总截面积分为三个相等的区域,并定义为外区、中区和内区,在 8 psi 和 12 psi 下外区活细胞比例分别为 24.49% 和 29.1% ,内区活细胞的比例分别为 45% 和 37.7% 。另外,外区死亡细胞的比例为 50% 和 44.8% ,而内区死亡细胞的比例为 18.39% 和 23.3% ,这种活/死细胞的空间变化主要原因为剪应力空间分布不同。

上述细胞活力和生物兼容性使用 Live/Dead 方法测定,采用 ReadyProbes™ 细胞活力成像试剂盒, Lionheart FX 进行成像 ,成像采集模式为 z-stack 模式, 50μm 层切, Beacon 随机选取位置(n = 5),其他成像参数保持恒定,细胞活力的百分比为活细胞总数与细胞总数之比。

四 微孔板检测技术推动生物墨水研究发展

Agilent-BioTek 的微孔板成像技术,不仅能助力生物 3D 打印技术生物墨水的开发,其多模式成像与检测分析方法也能为生物3D打印提供多维度的质控和功能性研究,满足研究者的各类检测需求。

1. 细胞毒性测试:

采用 MTT 实验验证不同生物墨水材料打印产生的细胞毒性。

2. 溶血实验:

将不同材料的生物墨水在 37℃ 下浸泡在生理盐水中,72h 后进行溶血测试,即提取上清液在 545nm 处测定光密度值,计算溶血率(%)。

3. 蛋白吸收实验:

将生物墨水浸泡在 FBS 溶液中,37℃ 孵育 24h,DPBS 洗涤去除非吸附蛋白,利用 Bradford assay kit 检测生物材料吸收蛋白的含量。

4. 细胞增殖实验:

细胞负载的生物墨水样本进行活细胞培养,在不同时间点进行 CCK8 测试,检测不同生物墨水负载后细胞的增殖能力。

5. ALP 活性/钙沉积实验:

细胞在支架表面黏附增殖后,在成骨培养基中逐渐分化,通过 ALP 活性实验和钙沉积实验评估 3D 支架的成骨能力,ALP 活性采用 ALP 检测试剂盒在 405nm 检测吸光度,钙沉积采用 ARS 染色法,在 540nm 处检测吸光度。

结语:

在生物 3D 打印技术研究中,生物墨水的可打印性,剪切应力导致的细胞损伤,打印完成后的生物兼容性以及打印细胞的功能性都是影响打印结果的重要因素。

我们很高兴的看到在这些研究论文中,Agilent-BioTek 提供的现代化微孔板成像技术平台以及优异的微孔板检测技术,帮助研究者们实现细胞活力、细胞增殖、细胞毒性等多维度的实验研究,为生物 3D 打印技术的快速发展贡献了我们的力量。

References:

[1].Jin, Z., et al., 3D Printing of Physical Organ Models: Recent Developments and Challenges. Advanced Science, 2021. 8(17): p. 2101394.

[2].Md Ahasan Habib, B.K., Rheological analysis of bio-ink for 3D bio-printing processes. Journal of Manufacturing Processes.

[3].Chang, H.K., et al., 3D printing of cell-laden visible light curable glycol chitosan bioink for bone tissue engineering. Carbohydrate Polymers, 2022. 287: p. 119328.

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