专家经验谈 | 空间生物学的样本制备和实验设计

【字体: 时间:2022年11月17日 来源:生物通

编辑推荐:

  Biocompare近日举办了一场研讨会,邀请多名科学家来分享他们使用各种空间生物学技术的经验和做法,包括样本制备、实验设计和数据分析。下面是研讨会上重点讨论的三个问题。

空间生物学,无论是空间基因组学、蛋白质组学还是转录组学,都能够为细胞功能增添形态背景,有助于人们更深入地了解组织微环境。Biocompare近日举办了一场研讨会,邀请多名科学家来分享他们使用各种空间生物学技术的经验和做法,包括样本制备、实验设计和数据分析。下面是研讨会上重点讨论的三个问题。

空间背景真的重要吗?

澳大利亚哈里•帕金斯医学研究所的博士后研究员Jennifer Currenti解释说:“我们的工作处在肿瘤发生、炎症和胚胎发生的交叉点,我们在鉴定参与癌胚重编程的细胞。”她正利用单细胞和空间技术来研究胎儿和肿瘤微环境的相似性,重点是肝细胞癌中的T细胞。

“单细胞分析并不能告诉你不同的细胞是如何相互作用的,”Currenti指出。“为此,你需要空间生物学。”空间技术帮助她确定参与其中的细胞在哪个位置,以及它们如何相互作用。她计划使用这些空间数据来评估癌胚重编程对免疫检查点抑制剂疗法的影响,这有望为患者量身定制免疫疗法。

Yered Pita-Juárez博士任职于哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心。他正利用COVID-19患者的尸检样本,研究SARS-CoV-2感染对肝脏的影响。“我们想看看SARS-CoV-2病毒是否存在于肝脏中,以及COVID-19如何影响肝脏,”他解释说。

通过病毒载量分析、原位杂交和单细胞核RNA测序,他们发现SARS-CoV-2确实存在于肝脏中。之后利用病毒和人类基因的特异性探针以及空间转录组学,他们能够定位肝脏样本中病毒存在的具体区域。

同样地,维康桑格研究所的博士后研究员Jimmy Lee也在用空间生物学来研究COVID-19,他在肺部组织上分析疾病的病理生理学。“我们已经采用传统的组织学和病理学知识以及空间转录组学来绘制肺部损伤随时间和空间的变化,并确定治疗干预的靶点,”Lee报告说。

他们绘制了疾病进展各个阶段的细胞空间图谱。他们发现,尽管疾病早期和晚期的细胞组成大致相似,但在COVID-19的晚期阶段,新的细胞(如免疫细胞)会浸润到肺部,造成形态上的变化。

研究整张切片还是某些区域?

这是一种权衡。数字空间分析(DSP)技术可使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本或新鲜冷冻的组织样本,对感兴趣区域中的RNA或蛋白进行研究。“在选择感兴趣的区域时,可根据它们在组织中的位置或某些形态特征,”Currenti说。所选区域的直径通常高达600 μm,而且分辨率往往很高,这就使得单细胞分析成为可能。

当然,人们也可以对整张组织切片进行分析以研究FFPE或新鲜冷冻样本中的RNA或蛋白,但分辨率较低。Currenti正在研究一种基于芯片的整张组织切片分析技术,该技术目前尚未上市,但可用来研究新鲜冷冻组织中单个细胞中的RNA。

“将组织切片放在芯片上,芯片上有空间条形码探针,”Currenti解释说。“在捕获mRNA并合成cDNA之后,构建cDNA文库,然后进行测序。”不过,这种技术的局限性在于单细胞分辨率使得可鉴定的基因数量减少,而且它不能用于FFPE样本,也不能研究蛋白质。

Jimmy Lee则采用全基因组组织分析来绘制肺部的细胞景观图。“我们的合作伙伴发现,同一张肺部切片的不同区域存在不同程度的肺泡损伤。因此,我们需要最大限度地发挥灵活性,观察同一样本中的不同区域,而不仅仅是感兴趣的区域。”

为了克服转录组分析中缺乏单细胞分辨率的问题,该实验室开发出一种称为Cell2Location的贝叶斯模型,以单细胞肺部图谱作为参照来鉴定某个感兴趣区域中的细胞类型。“这个模型的美妙之处在于,我们能够绘制每个区域中的细胞类型,并估计每种细胞类型的丰度,以便实现定量分析,”Lee说。

如何处理具有挑战性的样本?

Currenti解释说:“空间分析非常复杂,每个小细节都不能放过。”组织样本的质量很重要,特别是当样本很珍贵或数量很少时,最好先做个预实验,解决所有的问题。在整个流程中,从获得组织切片到文库制备和测序,样本制备可能最具挑战性。

“肝脏是一种比较棘手的组织,我们必须优化mRNA捕获和cDNA合成等步骤,”Currenti解释说。透化时间是至关重要的,可以确保你捕获到足够的mRNA,以便观察到各个不同区域,并避免RNA扩散到细胞外。“在保持细胞轮廓的同时看到细胞内部的结构元素,这是一种精妙的平衡。因此,我们需要借助显微镜来确定适当的透化时间。”

同样地,确定逆转录(RT)时间也很重要。“在我们的实验中,逆转录是在孵育器中进行的,而不是热循环仪,而且时间因样本而异,”Currenti谈道。“我们必须确保有足够的cDNA来构建文库。”

尽管肝脏样本不好处理,但据 Pita-Juárez 介绍,肝脏是空间转录组学研究的主要对象,因为它是一个高度结构化的器官。利用基因表达数据和通路分析,他们能够概括肝脏的结构,并观察感兴趣的区域。“我们能够整合单细胞核RNA测序和空间转录组学分析的数据,更好地了解COVID-19对肝脏的影响。”

研究人员认为,空间生物学实验中的许多决策都是由样本类型和研究问题决定的。当然,很多时候也取决于经验和规划,需要根据实际情况来灵活地优化和调整。

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号