从分析到育种,HiFi测序助力动植物体系化研究

【字体: 时间:2022年11月18日 来源:基因有限公司

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  自2017年提出以来,“优薯计划”取得了一系列成果,在国际顶级期刊发表多篇重量级文章,这其中就少不了HiFi测序的身影。我们一起来看看HiFi有着怎样的贡献吧~

马铃薯是世界上最重要的块茎类粮食作物,养活了全球大约13亿人口。栽培马铃薯是同源四倍体,主要靠薯块进行无性繁殖。并且马铃薯的基因组高度杂合,有害突变镶嵌在四套染色体中,依靠复杂的遗传重组才能使优良基因聚合。目前广泛种植的一些四倍体品种,例如美国的Russet Burbank(1902年育成)等已经有上百年的历史,这表明改良四倍体马铃薯难度高、见效慢。

随着基因组测序和育种技术的发展,中国农业科学院农业基因组研究所黄三文研究员联合各优势单位发起了“优薯计划”,即运用基因组设计的理论和方法体系培育杂交马铃薯,用二倍体育种替代四倍体育种,并用杂交种子繁殖替代薯块繁殖。自2017年提出以来,“优薯计划”取得了一系列成果,在国际顶级期刊发表多篇重量级文章,这其中就少不了HiFi测序的身影。我们一起来看看HiFi有着怎样的贡献吧~

01 单倍型分型的基因组组装

二倍体马铃薯

为探究自交衰退的遗传基础,从而为培育优良的二倍体自交系提供指导,他们对二倍体马铃薯进行了基因组组装,并在Nature Genetics杂志发表了研究成果。

该研究所采用的二倍体马铃薯品系RH,基因组杂合度高达2%,存在大量相似的同源片段。这种重复序列多的基因组组装困难,对高杂合基因组进行分型也是一个很大的挑战 。

研究人员采用了二代和三代测序结合的方法进行了基因组组装,尤其是利用HiFi测序获得了高准确率、高连续性(contig N50 达到2Mb)的组装片段,并且成功区分成两套单倍型,在遗传图谱和Hi-C数据的辅助下成功实现了染色体级别的单倍型组装。

对基因组的两套单倍型进行比较,发现二倍体马铃薯内存在20583个可能引起基因功能变化的有害突变,并且这些有害突变分散在两个单倍型中,呈现马赛克式交叉分布。

研究人员重点关注了1号染色体上的幼苗白化基因(WS1/ws1)和株型基因(PA1/pa1)。这两个基因的有害基因型(ws1和pa1)位于两条等位基因上且与正常基因型(WS1和PA1)紧密连锁(图1),并且在2000个自交后代中仅观察到2株分离个体,说明通过表型选择的传统杂交手段消除有害突变、积累优良基因十分困难。


图1.两个连锁的有害基因(ws1,pa1)定位

该研究完成了杂合二倍体马铃薯染色体级别的单倍型组装,通过分析有害突变,发现了有害基因和正常基因的紧密连锁现象,为快速打破有害等位基因连锁、构建优良自交系提供了基因组学支持。

四倍体栽培马铃薯

解析栽培马铃薯基因组对挖掘和利用有益基因、开展分子育种十分重要。所以他们选择了一种抗晚疫病的高产商品化同源四倍体马铃薯品种Collication-88(C88)进行测序和基因组组装。

同源多倍体的基因组组装,最大的挑战在于区分高度相似的同源染色体序列。

在本研究中,作者使用HiFi测序获得了高准确度序列,并在全基因组组装图中引入了“polyploid graph binning”方法,利用分组信息辅助区分四套同源染色体。最终获得 3.15 Gb组装序列,其中3.03 Gb 被锚定到48条染色体上,并且检测到44个端粒。Contig N50可达18.78 Mb,BUSCO完整性达到98.4%,并且包含有很多未报道过的近着丝粒区域序列。

通过比较基因组学和遗传学分析,研究人员发现同源染色体之间存在大量的序列差异,并且亲本之间存在有害突变基因型的互相掩盖和功能基因的互补(图2)。


图2.父本和母本染色体上的有害突变和功能基因

C88的母本为印度马铃薯I1085,其具有优良适应性和一般抗性;父本为来自S. tuberosum群体Andigena品种的不明抗枯萎病种质,晚疫病抗性强而适应性较差。对父母本染色体进行比较,发现父本染色体携带的2366个纯合有害突变会被母本染色体掩盖成杂合状态,降低了有害突变的不良影响。而C88父本染色体贡献了两个抗晚疫病基因R1,R2,是C88优良抗性的来源。对同源染色体上有害突变和功能基因的分析,能够为马铃薯基因组设计育种选择合适的亲本提供全面的信息。

02 泛基因组构建

为了对野生和栽培地方马铃薯基因组的进化和多样性有更深理解,研究人员通过HiFi测序组装了44个高质量的二倍体马铃薯基因组和马铃薯姊妹类群Etuberosum的2个基因组。通过构建泛基因组对马铃薯进化、薯块发生的机制、大片段倒位变异等进行了分析,相关研究结果发表在Nature杂志。

系统基因组关系的广泛不一致表明了马铃薯进化的复杂性。研究人员发现,与种子繁殖的茄科作物相比,马铃薯的抗病基因大幅增加,这说明地下薯块更容易受到病原菌的侵染,从而促进抗病基因扩张,对马铃薯基因组进化产生影响。

研究人员利用基因组分析和基因编辑技术CRISPR–Cas9,确定了一个先前未知的参与块茎形成的基因,将其命名为薯块身份基因Identity of Tuber(IT1)。通过酵母双杂进一步证明,IT1蛋白与一种名为SP6A的信号分子相互作用,参与块茎的形成(图3)。


图3.多组学比较分析鉴定马铃薯薯块身份基因IT1

除此之外,研究人员还关注了结构变异,并且首次构建了栽培和近缘野生马铃薯的大片段倒位图谱。其中,马铃薯3号染色体5.8 Mb倒位事件与类胡萝卜素积累基因紧密连锁,并且在自交后代中该区域的重组率显著降低(图4)。该现象为自交系的改良和去除潜在的连锁累赘提供了重要思路。


图4.基于泛基因组的大片段倒位图谱

这里的倒位事件虽然长达5.8Mb,远远超过了HiFi测序的读长(10-25kb),但是由于HiFi测序长而准,所以能够组装出Mb以上的contig(文中contig N50已经达到22Mb),可以跨过倒位区间。所以说,针对超长片段结构变异,HiFi测序可以通过组装拼接的方式跨过变异区间,从而实现变异的检测,大大提升结构变异的检测效率。

03 基因组赋能育种

进行了这么多突破性研究,黄三文团队在其中有没有获得过实实在在的杂交种子呢?

当然有!

前面有害突变部分也提到了,基于传统育种策略,难以克服有害突变导致的自交衰退问题,必须采用基因组设计育种才能有效地淘汰有害突变。所以他们借助在基因组学研究方面的优势,利用基因组大数据进行育种决策,建立了杂交马铃薯基因组设计育种流程,并成功获得了二倍体杂交马铃薯品种,这个重磅研究也登陆了Cell期刊。

研究团队在基因组设计中应用的指标包括基因组同源性、起始材料有害突变的数量,S1群体中分离畸变的数量,推断有益等位基因和有害等位基因之间紧密连锁的单倍型信息,以及亲本的基因组互补,HiFi测序在这些信息的获得中起了决定性的作用。基于基因组设计育种,他们开发出了纯合、可育的二倍体马铃薯品系 “优薯1号”。“优薯1号”具有显著的产量杂种优势,干物质含量和类胡萝卜素含量高,蒸煮品质佳。这是“优薯计划”从0到1的里程碑式突破!

除此之外,他们还创制了马铃薯单倍体诱导系,利用双单倍体技术构建高纯度二倍体马铃薯自交系可以显著加快自交系的选育进程和效率,为二倍体马铃薯杂交育种提供了强有力的技术保障,相关研究发表在aBIOTECH杂志。

Summary

总的来说, HiFi测序在马铃薯的高质量基因组组装、单倍型分型、结构变异的检测、泛基因组的构建乃至设计育种上都有很重要的作用。有了HiFi测序技术,有助于去建立一个真正从分析到育种、从理论指导到实践检验的平台,实现对特定动植物基因组的体系化研究!

参考文献:
1. Haplotype-resolved genome analyses of a heterozygous diploid potato. Nature Genetics (2020). DOI: 10.1038/s41588-020-0699-x
2. Genome architecture and tetrasomic inheritance of autotetraploid potato. Molecular Plant (2022). DOI: 16.10.1016/j.molp.2022.06.009
3. Genome evolution and diversity of wild and cultivated potatoes. Nature (2022). DOI:10.1038/s41586-022-04822-x
4. Genome design of hybrid potato. Cell (2021). DOI:10.1016/j.cell.2021.06.006
5. Construction of homozygous diploid potato through maternal haploid induction. aBIOTECH (2022). DOI:10.1007/s42994-022-00080-7

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