简介 受精后，哺乳动物的受精卵经历着床前胚胎发生，在此过程中，一系列快速而同步的细胞周期产生了适于着床和发育的囊胚( 1, 2). 着床前胚胎发生的关键步骤是启动合子基因激活（ZGA）和建立全能性，并伴随着转座因子（TE）的突然表达( 三– 5). ZGA过程中TEs的激活被认为与染色质开放和早期基因表达有关； 然而，TE活性对基因组的完整性构成了严重的威胁，因为这些元素随机地整合到以前未被确认的基因组位点中。
连续的TE扩增已经产生了超过三分之一的小鼠基因组，长时间散布的核元素-1（LINE-1或L1）转座子代表了最丰富的TE类。 L1元素构成了小鼠基因组的19%，并通过一种称为逆转录转位的“复制粘贴”遗传机制进行繁殖( 6). 在小鼠基因组中发现了超过90万个L1序列( 7)，其中约3000人仍能胜任转位( 8– 10). 一个具有反转转位能力的L1由一个5′非翻译区（5′UTR）、两个开放阅读框（ORF1和ORF2）和一个以聚腺苷酸（poly-A）序列结束的3′UTR组成( 11). L1的逆转转位是通过靶位点启动的反转录发生的( 12). l1mrna指导两种蛋白质的翻译，L1-ORF1p和L1-ORF2p，它们分别对应于这两种orf( 11). 在细胞质中，L1-ORF1p通过其RNA结合和分子伴侣活性介导核糖核蛋白（RNP）形成l1mrna、l1orf1p和l1orf2p( 13, 14). RNP复合物导入细胞核，l1mrna作为模板，通过L1或f2p的逆转录酶活性生成cDNA( 15). 最后，将cDNA与基因组DNA连接，基因组DNA具有由L1或f2p的内切酶活性产生的单链断裂( 16). 研究表明，某些疾病，包括某些类型的癌症、血友病A/B和严重的联合免疫缺陷都可以由有害的L1插入引起( 17). 由于其潜在的高致突变性，L1基因座在大多数组织中被抑制的表观遗传修饰严格沉默( 18). 然而，在着床前胚胎中发生的表观遗传修饰被抹去，导致L1的广泛激活，从而危及基因组的完整性( 4, 18). 而植入前胚胎富含L1-RNP复合物( 5)，它们如何对抗L1倒转，目前还不清楚。
反式反应（TAR）DNA结合蛋白43（TDP-43）是一种抑制HIV-1基因表达和预防病毒感染的转录调节因子( 19). 已有研究表明TDP-43是一种RNA结合蛋白，具有mRNA转录、翻译、剪接和稳定性等多种功能( 20, 21). 肌萎缩侧索硬化症（ALS）危险因素的筛选表明，TDP-43的异位表达与人类胚胎肾（HEK）293T细胞报告系统L1逆转录酶活性降低有关( 22). 在 果蝇 TDP-43的过度表达或敲除（KO）可能损害Dicer-2/Ago2介导的小干扰RNA（siRNA）沉默系统( 23). 然而，TDP-43在体内L1中和中的因果作用，特别是在基因组完整性至关重要的着床前胚胎中，尚未确定。
在这里，我们发现TDP-43与小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的L1或f1p相互作用并抑制胚胎L1倒转。 我们的研究结果表明，TDP-43在着床前胚胎发生过程中起到了防止L1暴露的保护作用，并保护了基因组的完整性。
结果 TDP-43与L1或f1p相互作用，抑制L1倒转 我们试图通过鉴定与L1倒转所需因子相互作用的蛋白质，来描述植入前发育过程中L1逆转转位的抑制。 对于L1或L1移位是必要的( 14)在着床前胚胎中高表达( 5). 我们培养了抗小鼠L1或f1p的小鼠单克隆抗体( 图1A和图S1A），并证实了L1或f1p在mESCs和着床前胚胎中的表达( 图1、B和C). L1或f1p在整个胚胎的病灶中明显，并且在细胞膜附近均匀分布( 图1C以及图S1、B和C）。 在mESC培养中，双细胞胚胎样（2C样）细胞占总细胞数的不到1%，是一种罕见的具有全能特性的短暂群体( 24). ESCs与囊胚的内部细胞团相对应，2C样细胞具有类似于2C期胚胎的转录组，高表达2C特异性TE小鼠内源性逆转录病毒（MERVL）( 24)免疫荧光染色显示L1-ORF1p和MERVL群特异性抗原（Gag）均在2C样细胞胞浆中高表达和定位( 图1B).
图1 胚胎干细胞和小鼠着床前胚胎中L1或F1P的特性。
( A )野生型mESCs内源性L1或f1p的IP值，其次是WB。 n、 i，未免疫小鼠[免疫球蛋白G（IgG）对照]； 抗体，仅抗体。 ( B )野生型mESCs免疫荧光显示内源性L1或f1p和MERVL-Gag在2C样细胞中共定位。 图像是最大的 Z 共焦面投影。 ( C )小鼠胚胎二细胞（2C）晚期和四细胞（4C）期的免疫荧光。 L1或f1p定位于胚胎表面，病灶均匀分散。 另请参见图S1B。 图像是最大的 Z 共焦面投影。 微分干涉对比显微镜。 ( D )上图：mES:：TRE-3FLAG-Dux细胞系构建方案。 3FLAG Dux插入TRE启动子后，在强力霉素诱导下驱动下游基因表达。 下图：MERVL-Gag和L1-ORF1p在mES:：TRE-3FLAG-Dux细胞系中呈剂量依赖性上调。 ( E )mES：：TRE-3FLAG-Dux细胞的免疫荧光。 图像是最大的 Z 共焦面投影。 多西环素以剂量依赖性的方式表达。
Dux是一种在胚胎发生过程中激活2C特异基因的转录因子，异位表达Dux的ESCs获得2C样状态( 25). 为了评估Dux表达对逆转录转座子蛋白表达的影响，我们建立了Dux诱导的mESC株mES：：TRE-3FLAG-Dux( 图1D). MERVL-Gag和L1-ORF1p在mES:：TRE-3FLAG-Dux中的表达水平随着Dux的表达而增加，呈剂量依赖性( 图1，D和E).
接下来，从Dux诱导的2C样细胞中免疫纯化L1或f1p相关复合物（IP）( 图2A)并进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定其成分（表S1）。 如预期，L1或F1P在IP样本中高度富集。 在已鉴定的L1或f1p相互作用组中，根据经验选择了8个高浓缩蛋白进行进一步研究，并选择了一个低于我们显著性阈值的相互作用蛋白Gm21312作为对照( 图2B).
图2 TDP-43与L1或f1p相互作用并抑制L1倒转。
( A )多西环素诱导后mES:：TRE-3FLAG-Dux细胞L1或f1p相互作用蛋白的银染。 ( B )火山图显示LC-MS/MS鉴定的L1或F1P相互作用组。 横轴：原木 2 抗-L1或f1p-co-IP产物与未免疫IgG-co-IP产物的蛋白质信号富集倍数变化； 垂直轴： ? 日志 10 错误发现率（FDR）。 蓝点代表L1或F1P相互作用组中高度富集的蛋白质。 选择用于进一步筛选的蛋白质被标记。 ( C )逆转转位试验方案。 双价报告质粒[cep99-gfp-ORFeus-Mm（EF1α-EF1α）；参见材料和方法]编码一个可转位的L1，然后是一个反义的EGFP盒，由内含子中断。 一旦转录，内含子被剪接，包含不间断反义EGFP盒的成熟mRNA可以被插入宿主基因组，形成EGFP阳性细胞。 TSD，目标站点复制。 ( D )用荧光活化细胞分选法（FACS）观察L1或f1p相互作用对HEK293T细胞L1逆转转位的影响（B）中候选蛋白的异位表达。 TDP-43的过度表达显著抑制L1后移。 阴性对照代表细胞转染空载体。 ( E )使用mES:：TRE-3FLAG-Dux lysate进行L1或F1P的IP，然后是WB。 内源性L1或f1p与TDP-43相互作用。
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然后我们进行L1转位分析( 26, 27)在所选择的相互作用因子存在下，检测这些蛋白是否能够抑制L1倒转( 图2C). 简单地说，二价L1报告质粒编码一个易位的L1，接着是一个反义增强型绿色荧光蛋白（EGFP）盒，被一个义内含子打断。 在L1转录后，EGFP中的内含子被剪接，处理后的含有完整反义EGFP盒的mRNA可以被反转录并插入宿主基因组，从而导致EGFP阳性细胞发生了逆转转位，并可以通过流式细胞术检测到。 为了验证该方法可用于检测HEK293T细胞的逆转转位抑制，我们证实了给予替诺福韦后，逆转转位频率的剂量依赖性降低，特诺福韦特别抑制逆转录（图S2，a和B；也可参见材料和方法的详细信息）。 在HEK293T细胞中对编码所选L1或F1P相互作用蛋白的cDNAs异位表达的HEK293T细胞进行了该逆转转座试验（图S2C）。 用EGFP阳性细胞群测定，转染质粒表达的细胞的反转位频率明显降低 Tardbp公司 ，编码TDP-43蛋白( 图2D以及图S2D）。 相反，TDP-43的过度表达不影响报告基因的剪接和表达（图S2，E和F）。 多西环素处理mES：：TRE-3FLAG-Dux细胞的Co-IP和Western blotting（WB）( 图2E)证实TDP-43是L1或f1p的真正的相互作用者。
合子TDP-43敲除导致L1倒转和发育缺陷增加 由于我们发现TDP-43在体外抑制L1倒转，我们接下来研究了它在植入前发育中的作用。 我们首先分析了先前发表的单细胞RNA测序（RNA-seq）数据( 28)确定着床前的表达谱 Tardbp公司 整个小鼠胚胎（图1和B）。 同时 Tardbp公司 L1家庭都是母系遗传， Tardbp公司 在进行性诱导前，转录本在2C中期明显减少，而L1家族转录本在受精后逐渐增加，在2C中后期达到最高水平。 我们制备了抗TDP-43的单克隆抗体，免疫荧光染色显示TDP-43在细胞核内富集( 图3A以及图S3C）。
图3 合子TDP-43kd导致L1后移位增加。
( A )以siRNA为靶点注射对照品（siScramble）或TDP-43（siTardbp）的受精卵的免疫荧光。 TDP-43kd桑椹胚显示TDP-43信号显著降低。 图像是最大的 Z 共焦面投影。 ( B )表达水平 Tardbp公司 用RNA-seq分析有无KD。 ( C )使用针对活跃L1亚家族的引物集的qPCR( 29)以5个囊胚（4.5dpc）±TDP-43kd的WGA-DNA为模板。 活跃的L1亚家族在TDP-43kd胚胎中表达增加** P ≤ 0.01和*** P ≤ 0.001( D )MA，显示TDP-43kd胚胎中TEs表达变化的平均图。 横轴：原木 10 标准化读取计数（基本平均值）； 纵轴：原木 2 KD胚胎与对照胚胎表达水平的倍数变化。 L1元素以红色突出显示，这里我们在RNA序列分析中采用重复掩蔽子的L1分类，因此L1Md_A对应于L1MdA_I、L1Md_AII和L1Md_AIII亚家族； L1Md_T对应于亚家族T F 还有G F ; L1Md_F2对应于L1Md_AIV、L1Md_AVII和L1Md_F； L1Md_F3对应于剩余的A亚家族和L1Md_N_I的部分( 30). ( E )靶向富集测序用于检测TDP-43kd胚胎（4.5dpc）和对照胚胎（4.5dpc）中先前未标记的L1插入位点。
然后我们询问TDP-43是否能保护着床前胚胎免受L1倒转。 采用微量rna-43基因敲除技术 Tardbp公司 （siTardbp）进入雄性合子原核。 免疫荧光染色未检测到TDP-43，RNA序列显示 Tardbp公司 水平下降到低于对照桑椹胚的20%（西斯克拉姆； 图3，A和B). 尽管TDP-43KD胚胎似乎在生后4.5天（dpc）经历了正常的发育进程（图S3、D和E），但TDP-43KD胚胎的体积几乎是对照胚胎的一半（图S3F），表明存在严重的细胞生长缺陷。 值得注意的是，用来自TDP-43kd囊胚（4.5dpc）的全基因组扩增（WGA）DNA定量聚合酶链反应（qPCR）显示l1a，G F ，和T F 亚科( 图3C)，据报道，它们在进化上是年轻的，能够进行逆向转位（图S3G）( 8– 10, 29, 30). RNA-seq同样显示活跃的L1在TDP-43kd胚胎中的表达普遍上调( 图3D，图S3H和表S2）。 为了证实这一发现，我们通过测序转座子插入分析（TIP-seq）对L1插入进行了靶向富集测序( 31)使用WGA DNA，至少在5号染色体上扩增β-肌动蛋白基因没有偏见（图S3、I和J；也可参见材料和方法）。 我们发现TDP-43 KD胚胎（4.5 dpc）中推测的新生L1插入量比对照组（4.5 dpc）增加了近70%； 图3E以及表S3）。 来自TIP-seq分析的原始序列数据显示，如前所述，不同起源的l1基因被逆转到染色体上富含A的区域( 11). 在TDP-43缺失的情况下，这些位点可能为着床前胚胎发生中的L1逆转转位提供热点（图S3K）。 也发现了少量的控制胚胎特有的L1插入，这表明L1逆转转位的基本频率是在胚胎发生过程中自然发生的( 32)，可以通过菌株特定的基因组序列进行修改，或者其鉴定可能受到统计能力的限制（表S4）。 总的来说，TDP-43kd胚胎的DNA扩增和活性L1的表达增加表明，TDP-43在胚胎发生早期抑制L1倒转。
mESCs中TDP-43突变导致L1倒转增加 TDP-43ko导致胚胎致死( 33)阻止了对体内长期TDP-43缺失对L1逆转转位的影响的研究，因此我们接下来询问TDP-43是否也有助于抑制mESCs中的L1逆转转位，mESCs可以重现植入前胚胎，并且易于接受基因操纵。 我们证实内源性TDP-43在mESCs中大量表达，并且可以通过siRNA对其进行短暂的敲除 Tardbp公司 （siTardbp；图S4A）。 我们在接受TDP-43kd的mESCs中进行了逆转转座实验，发现大约30%的逆转转位频率增加，而TDP-43kd并不影响报告基因的剪接( 图4A以及图S4B）。 然后，我们尝试用CRISPR-Cas9研究mESCs中KO-TDP-43长时间去除对L1逆转的影响 Tardbp公司 ( 图4B)用Cas9和嘌呤霉素抗性盒设计并克隆到表达质粒中。 将质粒转染mESCs并进行嘌呤霉素筛选，得到三个克隆（#3、#11和#14），与野生型mESCs相比，生长率降低（图S4C）。 基因分型显示，由于外显子2跳过，这些克隆中的TDP-43没有前84个氨基酸，而是从外显子3的另一个起始密码子翻译而来（图S4D），导致TDP-43ΔN突变( 图4B). 这三个突变克隆都有相同的mRNA序列，但基因组DNA序列不同（图S4D）。 ΔN突变体的cDNA被克隆并在mESCs中过度表达，并被证实与在ΔN突变体细胞系中检测到的产物大小相同（图S4E）。 在TDP-43ΔN突变体克隆中，尽管TDP-43被截短，但活跃的L1亚家族的DNA量增加了20-40%( 图4C). 此外，我们对野生型mESCs和ΔN突变细胞系进行免疫荧光染色，发现L1或F1P的荧光信号在细胞核中显著升高（图S4F），同时L1或F1P表达增加（图S4G）。 TDP-43含有一个二分核定位信号（NLS）结构域（81到87个氨基酸和94到100个氨基酸）( 34). TDP-43的ΔN突变体尽管缺少部分结构域（图S4、D和F），但仍定位于细胞核，表明剩余的NLS结构域可能在ΔN突变体中暴露并发挥功能。 除了证实TDP-43抑制mESCs的L1倒转外，这些结果表明TDP-43的N端结构域对该功能起重要作用。
图4 .mESCs中的TDP-43突变导致L1反转移位增加。
( A )用对照和 Tardbp公司 -靶向siRNA用于逆转录转位试验（见 图2C)由FACS分析。 实验时间进程如上图所示。 转染siTardbp的细胞与siScramble相比，逆转转位频率增加。 ( B )顶部面板说明了使用CRISPR-Cas9和四个GRNA来KO TDP-43的策略。 得到的克隆被注释为TDP-43ΔN细胞系（#3，#11，和#14）。 分离出这三个单克隆株系，用抗TDP-43c端抗体检测N端截短的TDP-43。 另请参见图S4（C和D）。 ( C )qPCR使用针对每个活跃L1亚家族的引物集( 29)在野生型和 ? N行。 TDP-43ΔN-mESCs活性L1亚家族DNA含量增加* P ≤ 0.05和** P ≤ 0.01。
TDP-43介导的L1逆转转位抑制需要与L1或F1P相互作用 然后我们试图揭示TDP-43介导的L1倒转抑制的结构基础。 TDP-43由一个促进均聚物形成的N-末端结构域、一个NLS结构域、两个RNA识别基序（RRM）结构域和一个无序的C-末端结构域组成，该结构域包含了大多数与ALS相关的突变，并映射到该基因上( 图5A) ( 35, 36). 由于mESCs中的TDP-43ΔN突变体导致L1逆转录转位的解除，我们首先询问TDP-43的N端结构域是否介导了它与L1或f1p的相互作用。 正如预期的那样，在ΔN突变体中，TDP-43表达抑制L1倒转的能力受损( 图5B与野生型TDP-43相比，L1或F1P共IP中TDP-43ΔN突变体的富集度相应降低( 图5C). 我们还证实了L1或f1p与TDP-43之间的相互作用与RNA的存在无关（图S5B）。 然后，我们利用三个TDP-43突变体来鉴定抑制L1倒转的功能域：氨基酸262到414的ΔC突变，具有F147/149L替换的RRM突变体，这些突变已经被证明会破坏RNA结合( 35)和具有K82/84A替代物的NLS突变体( 22)这削弱了它在全长蛋白中的不明确定位( 图5A). 在HEK293T细胞上的Co-IP实验表明，RRM突变体与L1或f1p结合的能力大大增强，而ΔC或NLS突变体的富集度没有明显变化( 图5D). HEK293T细胞的L1逆转转座实验表明，C端结构域的缺失严重影响了TDP-43抑制L1倒转的能力，而RRM突变体和NLS突变体则保持了它们的抑制能力( 图5E以及图S5C）。 与我们在mESCs和小鼠胚胎中的结果一致，野生型TDP-43定位于细胞核，L1或f1p遍布细胞质( 图5F); 正如预期的那样，NLS突变体未能进入细胞核，而是与细胞质中的L1或f1p共定位。 野生型和NLS突变体TDP-43均能有效地抑制L1倒转，且稳态亚细胞定位与L1抑制能力无相关性( 图5、E和F). 这些结果表明，TDP-43的N端结构域介导了与L1或f1p的相互作用，并在L1倒转抑制中起着重要作用，而TDP-43的C端结构域仅对抑制L1倒转起关键作用( 图5G). 由于L1-43和L1-P在亚细胞中的位置并不稳定，所以这也暗示了L1-43在稳定的位置上的相互作用。
图5 TDP-43介导的L1逆转转位需要与L1或F1P相互作用。
( A )TDP-43突变体在本研究中的应用。 ( B )基于流式细胞仪的逆转录转位分析（参见 图2C)结果显示，异位表达TDP-43ΔN突变体的HEK293T细胞中，逆转转位频率高于全长TDP-43。实验时间进程如上图所示。 ( C )通过对HEK293T细胞中L1-ORF1p的共诱导，检测了标记TDP-43ΔN突变体与L1-ORF1p之间的相互作用。 与野生型TDP-43相比，TDP-43ΔN突变体与L1或f1p之间的相互作用被削弱( D )用L1-ORF1p在HEK293T细胞中共诱导表达检测了标记TDP-43突变体（A）与L1-ORF1p之间的相互作用。 缺失C端结构域或NLS突变均不影响TDP-43与L1或f1p的相互作用。 ( E )过度表达TDP-43突变体的HEK293T细胞的L1逆转转位频率。 实验时间进程如上图所示。 TDP-43对逆转转位的抑制作用是由于C-末端结构域的丢失，而不是其他突变。 ( F )免疫荧光染色法对HeLa细胞L1或f1p和TDP-43突变体的亚细胞定位。 TDP-43nls突变体定位于细胞质，与L1或f1p有明显重叠。 ( G )TDP-43突变体特性汇总表。
讨论 着床前胚胎发生和配子发生是哺乳动物生命周期中两个主要的重编程事件( 18, 37). 这些事件伴随着TE表达的“爆发”( 三, 37– 39). 而原始生殖细胞通过利用P元素诱导的弱睾丸（PIWI）-PIWI相互作用的RNA途径来抑制基因组的完整性( 40)胚胎TE爆发是如何被抑制的，尤其是在早期的着床前阶段。 我们通过在小鼠着床前胚胎中发现TDP-43介导的L1逆转转位抑制来解决这个基本问题( 无花果。1到 三). 我们的数据表明，TDP-43的C-端结构域对于这个功能是必不可少的，而TDP-43的N-端结构域是其与L1或f1p相互作用所必需的( 图5). 我们发现内源性表达TDP-43ΔN突变体蛋白的mESCs中活跃的L1亚家族的DNA数量增加，同时L1或F1P表达增加( 图4以及图S4）。 我们的研究结果提出了一个模型，即TDP-43通过拦截接近染色体的L1-RNP复合体来保护胚胎基因组。
尽管大多数的逆转录转座子都被严重的截短或沉默，我们发现L1在胚胎发生的早期阶段具有转座能力。 显然，我们观察到TDP-43kd基因组整合L1拷贝数显著增加( 图3E以及图S3K）。 然而，l1dna的增加可能来自胞浆cDNA、外体cDNA环或第一链合成后停滞的RNA/DNA杂交体( 41)无法排除。 胞浆l1cdna中间产物的积累可能触发干扰素基因活性的环GMP-AMP合成酶刺激因子( 42)导致炎症反应，这可能导致胚泡缩小（图S3F）。 越来越多的证据表明，在年龄相关疾病中，细胞浆l1cdna的增加可以刺激I型干扰素反应( 43). 此外，在Aicardi-Goutières综合征（一种外切酶Trex1缺陷性疾病）中，L1衍生单链DNA水平升高也导致免疫反应异常激活( 44). 考虑到倒转的最后一步可能发生在细胞核内，cDNA中间产物向细胞质的转运机制仍不清楚。
TDP-43是一种高度保守和普遍表达的蛋白，属于异质核RNP家族( 45). TDP-43是一种RNA结合蛋白，具有mRNA转录、翻译、剪接和稳定性等多种功能( 20, 21). 如图所示。 S2E和S4B，KD/TDP-43的过度表达不影响报告基因的剪接和表达，说明TDP-43在胚胎发生过程中不通过剪接和翻译抑制L1倒转。 据报道，在神经病理学背景下，核TDP-43的丢失与L1基因座周围的染色质去浓缩和l1dna含量增加有关，这表明TDP-43促进L1位点周围异染色质的形成并抑制L1转录( 46). 然而，异染色质介导的转录沉默不太可能是L1抑制的机制，因为L1在着床前胚胎中高度转录。 在这个阶段，必须存在转录后抑制机制，而不是异染色质化的转录前抑制机制。
TDP-43突变与ALS高度相关( 36). 虽然ALS常与L1活性升高有关( 47, 48)TDP-43突变、L1逆转转位和ALS病理之间的因果关系仍在争论中( 22, 23, 47, 48). 其终末蛋白-43区突变高度相关( 36)，这对抑制L1倒转至关重要。 然而，大多数突变对HEK293T细胞的报告基因检测没有显著影响( 22). 我们的研究发现，TDP-43缺陷导致L1大量倒转并严重损害胚胎生长，这表明ALS病理学可能是由TDP-43功能障碍引起的累积L1倒转的结果。 尽管TDP-43是一种多功能蛋白，但在TDP-43缺失时，mESC生长速度的降低和囊胚大小的减小可能是L1基因大量逆转引起的基因组不稳定的结果。 以前发现TDP-43ko胚胎不能发育到8.5dpc以上( 33). L1的扩张是否会导致TDP-43ko胚胎的胚胎致死性仍有待研究，其在ALS病理学中的直接作用也有待研究。
我们已经证实TDP-43与L1或f1p之间的相互作用对抑制倒转至关重要，但确切的机制尚不清楚。 TDP-43是否能抑制L1或f2p的酶活性，物理隔离L1-RNP与染色体的接触，或促进L1-RNA的降解过程，尚待确定。
材料和方法 方法详细信息 单克隆抗体生产 8周龄雌性BALB/c小鼠每2周免疫一次，共6次，一周内增强2次。 根据制造商的说明，用等体积的滴度最大金佐剂（西格玛-奥尔德里奇）制备50微克抗原。 增强后4天，收集免疫小鼠的脾细胞，按照制造商的说明，使用ECFG21（Nepa基因）与SP2/O骨髓瘤融合。 融合细胞在GIT/IL-6/HT补充剂和氨基蝶呤培养基中培养1周，以筛选杂交瘤。 我们用培养上清液进行酶联免疫吸附试验、白细胞计数和免疫荧光法筛选杂交瘤。 采用连续稀释法对选择的杂交瘤进行单克隆。 单克隆杂交瘤在添加IL-6（1ng/ml）的GIT培养基（FUJIFILM Wako）中培养产生抗体。 用单克隆抗体试剂盒（Roche试剂盒）检测等型抗体。 动物实验经庆应大学动物护理与使用委员会批准，并遵照庆应大学研究伦理守则进行。
细胞培养 SP2/O骨髓瘤及其原代克隆在添加IL-6（1ng/ml；PeproTech）的GIT培养基（FUJIFILM Wako）中，在5%CO下培养 2 37°C时。 每天传代细胞，使细胞密度保持在0.2×10 6 至1.0×10 6 细胞/ml。 为了产生单克隆抗体，杂交瘤被培养到过度融合。 单克隆杂交瘤的上清液用0.22μm孔过滤器（Corning）消毒，并直接作为抗体溶液用于其他检测。
HEK293T细胞在杜尔贝科改良的Eagle培养基（DMEM）（高糖；Nacalai Tesque）中培养，该培养基补充10%胎牛血清（FBS；Biowest）、1×谷氨酰胺（Gibco）、1×丙酮酸钠（Merck）和50μM 2-巯基乙醇（Gibco）。 电池（5×10 5 )接种于60mm无包衣培养皿中，5%CO培养 2 37°C时。 细胞每3天传代一次。
HeLa细胞在添加10%FBS、1×谷氨酰胺、1×丙酮酸钠和50μm2-巯基乙醇的DMEM（高糖；Nacalai-Tesque）中培养。 电池（5×10 5 )接种于60mm无包衣培养皿中，5%CO培养 2 37°C时。 细胞每3天传代一次。
EB3 mESCs在DMEM（高糖；Nacalai Tesque）中培养，DMEM中添加10%FBS、1×谷氨酰胺、1×丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇、内部产生的小鼠白血病抑制因子、1μM PD0325901（FUJIFILM Wako）和3μM CHIR99021（FUJIFILM Wako）培养。 mESCs（1×10 5 )将种子植入iMatrix-511蚕丝（Matrixome）——预涂层35mm培养皿中，在5%的CO下培养 2 37°C时。 细胞每3天传代一次。
转基因mESC系的建立 如前所述，多西环素控制的mES：：TRE-3FLAG-Dux细胞系通过与pPB-TRE-3FLAG-Dux、pPB-CAG-rtTA3G和pCMV-HyPBase质粒共转染产生( 49). 转染48小时后，细胞接受潮霉素（500μg/ml；FUJIFILM Wako）和G418（500μg/ml；FUJIFILM Wako）选择7天。 然后将所选细胞接种在2×10 2 细胞/cm 2 在含有潮霉素（250μg/ml）和G418（250μg/ml）的培养基中。 7天后，取单细胞克隆进行扩增。
用pX330-puro-Tardbp-gRNA1、pX330-puro-Tardbp-gRNA2、pX330-puro-Tardbp-gRNA3和pX330-puro-Tardbp-gRNA4质粒共转染EB3-mESC株系。 24小时后传代细胞，用嘌呤霉素（0.75μg/ml；默克）筛选4天。 然后将所选细胞以50个细胞/cm的速度接种 2 在含有嘌呤霉素（0.75μg/ml）的培养基中。 7天后，取单细胞克隆进行扩增。
siRNA转染 mESCs经胰蛋白酶处理后用1×PBS（Nacalai-Tesque）洗涤一次。 电池（2×10 5 )按照制造商的说明，使用程序CG-104在96孔穿梭装置（Lonza）中转染40 pmol的siRNA和20μl的P3原代细胞核受体溶液（Lonza；补充1）。 然后将转染的细胞接种到iMatrix-511蚕丝预涂层培养皿中进行培养和进一步实验。
免疫纯化与白细胞 目的培养细胞经胰蛋白酶消化后用1×PBS洗涤一次。 适当数量的电池（1×10 4 用IP缓冲液[20 mM tris HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl和0.1%NP-40]重新悬浮细胞/μl，用Bioruptor II（BM设备）在高模式下进行5分钟的超声处理。 在17700离心裂解细胞溶液 g 在4°C下保持2分钟； 然后收集上清液作为IP的细胞裂解液。 将100微升抗体（培养上清液）与10μl Dynabears蛋白质G（Thermo Fisher Scientific）在4°C下接合30分钟，然后在IP缓冲液中清洗一次。 抗体结合珠与适量的细胞裂解液在4℃下培养2小时。 在Ameran-IP缓冲液中，用聚丙烯酰胺凝胶洗脱3次。 膜在PBS-T（0.1%Tween-20）中冲洗三次，封闭在2%脱脂乳中，然后在室温下在稀释的初级抗体中培养1小时。 在PBS-T中冲洗三次后，在1/5000稀释度的过氧化物酶偶联羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二级抗体（MP-Biomedicals）中室温培养30min。 膜在PBS-T中洗涤三次，用ECL-Western印迹检测试剂（GE-Healthcare）检测信号。
霰弹枪质谱分析 使用mES:：TRE-3FLAG-Dux裂解物[用多西环素（10 ng/ml）诱导20小时]和/不使用通过0.5%甲醛（Sigma-Aldrich）交联到珠子上的抗体进行L1或f1p的共IP。 用未免疫小鼠IgG（免疫生物学实验室）进行免疫沉淀作为阴性对照。 免疫沉淀剂在含有10 mM tris HCl（Nacalai Tesque）和1%十二烷基硫酸钠（FUJIFILM Wako）的洗脱缓冲液中通过在95°C下加热3分钟来洗脱免疫沉淀剂。 洗脱液用三氯乙酸/丙酮沉淀沉淀。 在室温下避光碘代乙酰胺溶液中烷基化1小时后，用氯仿/甲醇沉淀浓缩蛋白质，然后在37℃下用胰蛋白酶金（Promega）消化过夜。 采用LTQ Orbitrap Velos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）配备纳米LC接口（AMR，inc）进行肽分离和鉴定。 将数据与UniProt蛋白序列数据库进行比较 小肌 在搜索程序Proteome Discoverer 1.4（Thermo Fisher Scientific）中使用蛋白质鉴定。 这个 P 使用学生的 t 测试，然后 问 数值由Benjamini-Hochberg程序计算。 只使用在所有三个重复实验中检测到的蛋白质。 用PEP总分+1的平均值除以阴性对照的PEP总分+1的值来计算折叠变化。为了筛选L1或F1P相互作用子的候选蛋白质，具有超过16倍变化的蛋白质和 问 值<0.01被列为候选值。
L1逆转转位试验 L1逆转转位分析如前所述，并作了一些修改( 26, 27). 本研究以cep99-gfp-ORFeus-Mm（EF1αEF1α）为L1报告者。 该报告质粒基于cep99-gfp-ORFeus-Mm[cep99-gfp-L1SM in( 50)]将EF1α启动子插入L1盒和EGFP盒的上游5′utr，在mESCs中表达。 测定HEK293T细胞的转位效率，5×10 5 将细胞接种到0.001%的poly中- 我 -赖氨酸（Nacalai Tesque）-预涂六孔板，然后在37°C下培养过夜。 第二天（第2天），根据制造商的说明，使用5μl Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）和250μl Opti-MEM（Gibco）将总计2μg质粒DNA转染细胞。 第二天（第3天），对转染细胞进行胰蛋白酶处理，转染后细胞体积为1.5×10 5 培养皿中60.001%的细胞传代至mm- 我 -赖氨酸包被并在37°C下培养至第7天，无培养基变化。 第7天，收集细胞并在添加10%FBS的FluoroBrite-DMEM（Gibco）中重新悬浮，并使用流式细胞仪（SONY SH800Z）测量EGFP阳性细胞的比例。 在已建立的L1逆转录转座试验中，细胞通常是在转染L1报告者后选择的细胞，以浓缩表达外体L1报告者的细胞。 然而，在我们的研究中，服用嘌呤霉素会导致TDP-43过度表达的广泛细胞死亡，因此我们在没有选择嘌呤霉素的情况下进行了逆转转位试验，结果在基线条件下，1%至2%的EGFP阳性细胞保持一致。
对于mESCs，100μl 2.0×10 5 根据制造商的说明，使用2.5μl Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）和50μl Opti-MEM（Gibco）将细胞悬浮液与总1μg质粒DNA混合。 然后将细胞DNA混合物接种到iMatrix-511丝-预涂层96孔板中，在37℃下培养6小时，然后用新鲜胚胎干细胞（ES）培养基替换。 第二天（第2天），对转染细胞进行胰蛋白酶处理，转染后细胞体积为2.0×10 5 将细胞传至iMatrix-511丝质预涂层35mm培养皿中，培养基为嘌呤霉素（0.5μg/ml）（Sigma-Aldrich）ES培养基。 细胞在37℃培养至第5天，用嘌呤霉素（0.5μg/ml）ES培养基代替培养基。 第7天，收集细胞并在添加10%FBS的FluoroBrite-DMEM（Gibco）中重新悬浮，用流式细胞仪（SONY SH800Z）测定EGFP阳性细胞比例。
免疫荧光染色 将细胞接种在相应培养基中的盖玻片上（如需要，可预涂玻璃罩），第二天转染质粒dna。 转染48小时后，用4%甲醛固定于PBS-T中，室温30min。 固定细胞在PBS-T中洗涤一次，在室温下用0.1%tritonx-100（Bio-Rad）渗透30分钟。 用1%牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）在PBS-T中阻断细胞30分钟，然后在室温下用稀释抗体孵育1小时。 在PBS-T中洗涤三次后，细胞在1/1000稀释的Alexa-Fluor 488-或Alexa-Fluor 555-结合山羊抗鼠IgG二级抗体（Thermo Fisher Scientific）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（1μg/ml）中在黑暗中室温下培养30分钟。 在观察前，在室温下用延长玻璃防腐蚀贴片（Thermo Fisher Scientific）将玻璃盖安装在室温下过夜。 荧光图像用奥林巴斯FV3000共焦激光扫描显微镜拍摄。
为进行小鼠胚胎免疫荧光染色，取8周龄雌性B6D2F1小鼠交配后，分别注入150μl卡氏超卵子（KYUDO）和5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）（ASKA动物健康）后的胚胎。 将胚胎移入补充有透明质酸酶（0.3μg/μl）（Sigma-Aldrich）的胚胎培养基（KSOM培养基）（Sigma-Aldrich），然后在37℃的KSOM培养基中培养，直到发育到所需的阶段。 胚胎发育的胚胎用酸性酪氨酸溶液（Merck）处理，去除透明带（ZP），然后固定在4%多聚甲醛（Nacalai-Tesque）中。 固定胚在PBS中洗涤3次，室温下用0.1%tritonx-100渗透20分钟。 胚胎洗涤三次，然后在室温下用2%BSA（Sigma-Aldrich）封闭20分钟。 封闭的胚胎用稀释抗体在PBS中的2%BSA中在4℃下孵育过夜。 在PBS中洗涤三次后，将胚胎移植到1/500稀释的Alexa-Fluor 488或Alexa-Fluor 555-结合山羊抗鼠IgG二级抗体（Thermo Fisher Scientific）和1/200稀释的DAPI溶液（Nacalai Tesque）中，在室温下黑暗中孵育1小时。 胚胎用多溴联苯洗涤三次，然后转移到一个干净的PBS液滴中，在一个35毫米的有玻璃底的盘子里（松木玻璃），上面覆盖着石蜡液体（Nacalai Tesque）。 荧光图像用奥林巴斯FV3000共焦激光扫描显微镜拍摄。 动物实验经庆应大学动物护理与使用委员会批准，并遵照庆应大学研究伦理守则进行。
RNA分离与cDNA合成 根据制造商的说明，使用ISOGEN（Nippon基因）分离总RNA。 总RNA储存在 ? 80摄氏度。 根据制造商的说明，使用转录子第一链cDNA合成试剂盒（Roche）制备cDNA，并将合成的cDNA储存在 ? 20摄氏度。
全基因组扩增 取8周龄雌性B6D2F1小鼠，分别注入150μl的CARD HyperOva（KYUDO）和5iu的hCG（ASKA动物保健品），交配后采集小鼠胚胎。 胚胎移入添加透明质酸酶（0.3μg/μl）的KSOM培养基（Sigma-Aldrich），然后在37°C的KSOM培养基中培养。 微注射在0.5dpc下在配备有微操作系统（Narishige）的相差倒置显微镜（IX73，Olympus）下进行。 用femtojet4i（Eppendorf）将每个siRNA（20μM）微注射到受精卵的雄性原核中。 注入的胚胎在KSOM中培养，直到发育成囊胚（4.5dpc），然后用EmbryoMax酸性酪氨酸溶液（Merck）去除ZP。 收集5个注射西斯克拉姆或5个注射siTardbp的囊胚，按照制造商的说明使用REPLI-g单细胞试剂盒（QIAGEN）扩增基因组DNA。 每个样品产生三个生物复制品。 扩增后的基因组DNA作为qPCR和TIP-seq模板检测新的L1插入。 经庆应大学动物实验委员会和动物护理委员会批准。
基因组DNA制备与qPCR 基因组DNA提取以1.0×10开始 6 细胞。 新鲜收获的细胞用PBS洗涤一次，然后悬浮在500μl蛋白酶K缓冲液中【1×标准柠檬酸盐、20 mM tris-HCl（pH 7.9）、1 mM EDTA和1%SDS】。 用注射器将细胞颗粒完全溶解。 将10微升蛋白酶K（20 mg/ml）（FUJIFILM Wako）添加到裂解细胞溶液中，并在55℃下培养至少2小时。 向溶液中添加1微升核糖核酸酶A（RNase A）（10 mg/ml）（Nacalai Tesque），并在37°C下培养1小时。 通过加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）（Nippon Gene）和等体积的异丙醇（FUJIFILM Wako）沉淀基因组DNA，提取两次基因组DNA。 17700离心 g 在4°C下放置12分钟，然后去除上清液并用70%的冰镇乙醇（FUJIFILM Wako）洗涤DNA颗粒。 将DNA在室温下放置5分钟以使剩余的水分蒸发，并添加100μl TE（10 mM tris和1 mM EDTA）以溶解基因组DNA。 向基因组DNA溶液中添加1微升RNase A（1 mg/ml）（Nacalai Tesque），并在37℃下培养至少3小时。 用蛋白酶K缓冲液和3μl蛋白酶K（20 mg/ml）将溶液体积调节至500μl，并在55°C下培养1小时。 重复提取苯酚/氯仿/异戊醇两次，加入异丙醇沉淀基因组DNA并离心，然后用70%的冰镇乙醇洗涤DNA颗粒一次。 基因组DNA在室温下晾干不超过10分钟，然后溶解在100μl TE中。 用Qubit荧光计（Invitrogen）测量DNA和RNA浓度，并将DNA短期保存在4℃或 ? 长期储存20°C。
根据制造商的说明，在热循环骰子实时系统（TaKaRa）上使用TB Green Fast qPCR混合物（TaKaRa）进行qPCR。 使用的引物组如表S2所示。根据标准曲线的斜率计算qPCR的放大效率。 在确定扩增效率值后，用DNA的相对数量进行进一步计算。
L1插入连接的靶向富集测序 如前所述执行提示序列( 31). 简单地说，将10μg小鼠基因组DNA分别用6种限制性酶（AseⅠ、Bsp－HI、HindⅢ、Nco－I、Pst－I和Psu－I）消化，然后与载体适配器连接。 采用L1序列特异性引物结合适配器特异性引物（见表S2）进行载体PCR。 PCR产物用covariss2（M&S仪器）超声剪切，强度为4,10%占空比，每次爆发200个周期，每个样品100秒。 剪切后的DNA片段通过柱纯化，然后根据制造商的说明使用Illumina的NEBNext Ultra II DNA文库准备套件用于下一代测序文库构建。 用2100生物分析仪（安捷伦）用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒和Kapa文库定量试剂盒（日本遗传学）对文库进行定量分析。 相应地将量化的文库汇集起来，并使用MiSeq测序仪[Illumina；配对端，150个碱基对（bp）]和HiSeq X测序仪（Illumina；成对端，150 bp）进行深度测序。
生物信息学分析如逆转录转座子捕获测序（RC-seq）中所述进行( 26). 从原始序列中简单的修剪了L1序列。 使用fastpv0.23.2对修剪后的读数进行质量控制( 51). 质量控制的读取由flashv2.2.00处理( 52)使用默认参数合并重叠读取。 合并后的阅读与GRCm38.p6、C57BL/6NJ和DBA/2J参考基因组一致，使用bowtie2v2.4.1( 53)使用默认参数。 Reads映射到至少一个参考基因组，并注释L1位点被认为是种系起源。 从下游分析中排除了种系起源阅读。 使用最后一个v1256（-s2-l12-d30-q3-e30）提取未映射的读取并与活动的L1一致序列对齐( 54). 读取对齐 ≥ 使用Bowtie2 v2.4.1——非常敏感的局部模式，保留了53个核苷酸，且与L1一致序列的>95%相同，并与L1硬掩模GRCm38.p6参考基因组对齐。 三次以上的阅读所绘制的基因组位置，以及在对照文库或先前注释的L1基因座中缺失的位置被认为是体细胞插入。
单细胞RNA序列分析 原始的单细胞RNA序列数据来自Deng的数据集 等等。 （GSE45719）( 28). 使用fastpv0.23.2对原始测序读数进行质量控制。质量控制的读数首先通过胚胎阶段合并，并与已知小鼠te的参考序列进行比对，使用拼接转录本与参考（STAR）v2.7.9a进行比对，并使用默认参数； 每千基数每百万映射读取数（RPKM）-使用deepTools v3.5.1计算活动L1子家族的标准化读取覆盖率( 55)，bamCoverage函数（图S3B）。 然后使用starv2.7.9a将质量控制的读数与已知鼠标te的参考序列对齐( 56)使用默认参数。 阅读量根据GRCm38.p6综合基因注释进行计数( 57)和mm10重复来自加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）的RepeatMasker注释，使用subreadv2.0.1( 58)，featureCounts函数。 对于非TE特征，多重映射读取被丢弃，而对于TE则以分数形式计数。 对属于同一亚科的TE基因座计数进行下游分析。 Seurat 4.1.0版( 59)用于处理单细胞RNA序列的读取计数。 线粒体读数大于7.5%或注释特征少于14000个的细胞被丢弃。 表达水平被对数标准化。
RNA测序 根据制造商的说明，使用智能序列链试剂盒（Clontech）制备总RNA序列文库。 简单地说，19个siScramble注射或23个siTardbp注射的ZP游离胚胎直接在含有RNase抑制剂（0.2IU/μl；来自SMART Seq Stranded Kit，Clontech）的1×裂解缓冲液中裂解。 在85℃下加热8min剪切rna，并用随机六聚体和PCR扩增进行反转录。 用scZapR和scR探针从每个cDNA样本中去除核糖体片段。 索引的总RNA序列文库通过第二次PCR扩增富集，然后使用HiSeq X测序器（Illumina；成对末端，150 bp）进行测序。 每个样品产生三个生物复制品。 原始测序读取使用fastpv0.23.2进行质量控制。质量控制的读取首先使用starv2.7.9a和默认参数与已知鼠标te的参考序列对齐； 使用deepTools v3.5.1bamcoverage函数（图S3H）计算活动L1子家族的RPKM标准化读取覆盖率。 然后使用STAR将质量控制的读数与GRCm38.p6参考基因组对齐，并使用默认参数。 使用Subread v2.0.1 featureCounts函数根据GRCm38.p6综合基因注释和来自UCSC RepeatMasker注释的mm10重复进行计数。 对于非TE特征，多重映射读取被丢弃，而对于TE则以分数形式计数。 用DESeq2 v1.32.0对属于同一亚科的TE基因座计数进行差异表达分析( 60).
