人SNCA基因内含子增强子主要调控其在脑内的表达

　　

摘要

来自帕金森病（PD）患者和我们先前报道的α-突触核蛋白（SNCA）转基因大鼠模型的证据支持SNCA蛋白增加是PD发病的重要危险因素的观点。然而，关于人类的转录控制却知之甚少SNCA公司体内的基因。在这里，我们发现DYT6基因产物THAP1（含凋亡相关蛋白1的THAP结构域）及其相互作用伙伴CTCF（CCCTC结合因子）作为转录调控因子SNCA公司.THAP1控件SNCA公司内含子增强子的活性，而CTCF调节其增强子启动子环的形成。这个SNCA公司内含子增强子具有神经发育依赖性的活性，在大脑中形成类似于“超级增强子”的增强子簇，其中与PD相关的单核苷酸多态性丰富。删除SNCA公司内含子增强子簇阻止启动子释放暂停的RNA聚合酶II，随后大幅度降低其在大脑中的表达，这可能提供新的治疗方法，以防止其积聚，从而导致相关的神经退行性疾病被定义为共核细胞病。

简介

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种最常见的神经退行性疾病，其中αsynuclein（SNCA）编码SNCA公司基因，是路易体的主要组成部分(1,2).虽然单点突变SNCA公司基因可导致常染色体显性遗传的早发家族性帕金森病(三,4)一些证据支持增加野生型人SNCA（hSNCA）蛋白水平的剂量对PD的发病也至关重要。野生型的复制、三倍或重组SNCA公司基因引起家族性帕金森病，临床表型的严重程度与数量相关SNCA公司份数(5–7).此外，多态性SNCA公司增强SNCA表达的基因调控区与散发性PD相关(8,9).同样，过度表达人类野生型SNCA蛋白的小鼠和大鼠模型显示α-突触核细胞病变、黑质纹状体变性，甚至形成包涵体(10,11).此外，在PD死后的大脑中检测到SNCA转录水平的升高(12).到目前为止，SNCA是PD最有效和最有希望的治疗靶点之一，SNCA水平的控制已经显示出有益的影响(13,14).因此，破译SNCA公司将有助于我们确定新的治疗目标，以减少其在帕金森病患者中的表达。

到目前为止，只有少数转录因子SNCA公司基因已被报道。ZSCAN21和ZNF219可与SNCA公司激活或抑制SNCA公司抄写(15).其他转录因子如GATA2、EMX2、NKX6-1和CEBPD（CCAAT/增强子结合蛋白delta）结合启动子或潜在的增强子SNCA公司调节其表达的基因(9,16,17).多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1是另一种转录因子SNCA公司通过结合一个叫做NACP-Rep1的多态性微卫星区域来表达(18).其他独联体监管要素（CRE）SNCA公司基因，如增强子，也有报道(19).但是SNCA公司基因及其在体内的转录调控机制目前尚不清楚。

我们最近的研究显示SNCA公司在THAP1/DYT6肌张力障碍患者诱导的多能干细胞（iPSC）衍生中脑多巴胺能（mDA）神经元中(20).在这项研究中DYT6基因产物THAP1调节SNCA公司通过控制启动子和内含子增强子的活性在人和大鼠脑中的表达，而THAP1的相互作用伙伴CTCF（CCCTC结合因子）控制着THAP1的增强子启动子环的形成SNCA公司基因。我们进一步证明SNCA公司内含子增强子在神经发育过程中呈现细胞谱系依赖性活动，形成类似于大脑中“超级增强子”的增强子簇。与帕金森病风险高度相关的单核苷酸多态性（snp）在这些增强子簇区富集。删除SNCA公司内含子增强子簇阻止了它的转录延长，随后在大脑中的表达急剧减少，这表明靶向编辑SNCA公司内含子增强子可能是一种新的治疗方法来减少SNCA的表达，从而减少SNCA在大脑中的积累，有望预防SNCA相关的神经退行性疾病。

结果

THAP1突变抑制SNCA的表达

THAP1/DYT6肌张力障碍患者iPSC衍生mDA神经元（iPSC神经元）的RNA序列分析塔帕1杂合子敲除(塔帕1^+/?)多巴胺能的SH-SY5Y神经元细胞SNCA表达明显降低(20)，表明THAP1可能是SNCA公司扩大的Western印迹分析证实这些细胞中SNCA蛋白水平降低(图1，A和B).在THAP1突变患者的死后额叶皮质样本中，我们还观察到与神经正常死亡对照组相比，SNCA蛋白水平显著降低(图1C).相反，在SH-SY5Y和SK-N-AS神经母细胞瘤细胞中过度表达THAP1导致SNCA表达显著增加（图S1A）(21).以上结果提示THAP1可能调节SNCA的表达。

图1.THAP1调节SNCA的表达。

(A)Western印迹和统计分析表明，SNCA在THAP1患者iPSC神经元中的表达明显低于对照组。(B)在塔帕1杂合子敲除(塔帕1^+/?)多巴胺能的SH-SY5Y细胞、Western印迹和统计分析检测到THAP1和SNCA的表达明显低于对照细胞。(C)经Western印迹和统计学分析，THAP1患者额叶皮质SNCA的表达低于正常人。(D)westernblot分析显示hTHAP1和rTHAP1蛋白在不同脑区的表达塔帕1转基因大鼠(n=每组3只大鼠）。(E)免疫印迹和统计分析法测定人小脑内人SNCA（hSNCA）和rSNCA蛋白水平塔帕1和SNCA公司双转基因大鼠(塔帕1甘油三酯/SNCA公司tg）时，SNCA公司转基因大鼠(SNCA公司和非转基因野生型大鼠（非转基因）(n=每组5只大鼠）。(F)转基因大鼠皮层和非转基因nca蛋白表达水平不同(SNCA公司tg-L和SNCA公司三甘醇）(n=每组5只大鼠）***P<0.001****P<0.0001。用未配对的双尾比较t测试。

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人THAP1调节人和大鼠SNCA公司转基因大鼠脑组织中的表达

进一步证明THAP1在调节中的作用SNCA公司在大脑中表达，我们生成了THAP1过表达的转基因大鼠(塔帕1tg）通过原核注射全人类塔帕1基因（12 kb）（图S1B）。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分析均证实野生型人THAP1（hTHAP1）在不同脑区的表达塔帕1tg大鼠(图1D以及图S1C）。hTHAP1在小脑表达最高，与内源性大鼠THAP1蛋白（rTHAP1）的表达模式相似(图1D).我们还观察到hTHAP1蛋白的分子量略小于rTHAP1蛋白的分子量(图1D)，虽然hTHAP1的预测分子量为24.944kDa，略大于rTHAP1的预测分子量（24.688kDa）(www.uniprot.org).这些数据可能表明这两种蛋白质的不同翻译后修饰，如甲基化(22).

我们下一步杂交塔帕1tg大鼠与我们之前生成的人类SNCA公司转基因大鼠(SNCA公司tg）。这个SNCA公司tg老鼠庇护着整个人类SNCA公司基因序列（190kb）（GenBank AF163864），包括30kb的上游调控启动子序列、所有内含子区和45kb侧翼的下游区(11).在小脑人类SNCA和人THAP1双转基因大鼠(SNCA公司甘油三酯/塔帕1与对照组相比，大鼠SNCA（rSNCA）和hSNCA的表达均显著增加SNCA公司tg大鼠(图1E).hSNCA和rSNCA在纹状体和皮质的表达也增加，但其变化弱于小脑(图1E以及图S1、D和E）。hSNCA和rSNCA的表达变化与hTHAP1的表达水平有关，因为小脑比纹状体和皮质表达更多的hTHAP1蛋白(图1D).这些数据进一步证实了THAP1在体内调节SNCA表达的作用。

当比较SNCA公司用非转基因大鼠（非转基因大鼠），我们观察到rSNCA蛋白水平降低(图1E图S1，D和E），这可能表明hSNCA蛋白的过度表达抑制内源性rSNCA的表达。接下来我们分析了rSNCA、hSNCA和总SNCA（tSNCA）在两种不同组织中的表达SNCA公司转基因大鼠系SNCA公司表达高水平hSNCA蛋白和SNCA公司tg-L系，表达很低水平的hSNCA蛋白，观察到rSNCA蛋白仅在SNCA公司tg线但不在SNCA公司tg-L线(图1F以及图S1F）。这些数据表明SNCA具有自我调节功能，但只有当hSNCA蛋白达到一定的表达水平时才会发生。

THAP1调节SNCA公司启动子和内含子增强子

了解THAP1是如何调节的SNCA公司表达，我们检查了我们的THAP1染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据，并观察到弱结合信号SNCA公司发起人(图2A) (20).进一步荧光素酶报告分析证实野生型THAP1可以上调整个细胞的活性SNCA公司启动子[10.7kb翻译起始点上游(23)]（图S2A）。

图2.THAP1调节SNCA表达的机制特征。

(A)THAP1芯片序列在SNCA公司启动子（红色箭头），在IgG控制（1道和2道）中看不到。H3K27ac芯片序列定义SNCA公司SH-SY5Y细胞中的启动子和潜在增强剂，并显示其对SNCA公司基因控制（shControl）和THAP1基因敲除（shTHAP1）SH-SY5Y细胞（En-1:Chr4:90720577–90722136；En-2:Chr4:90673800–90675200）（3道和4道）。CEBPD和CTCF芯片序列显示它们在SNCA公司启动子和增强子（通道5和6）。(B)芯片qPCR分析其H3K27ac和H3K4me3在SNCA公司THAP1患者iPSC神经元和对照iPSC神经元中的启动子和增强子。(C)westernblot分析显示，在THAP1患者的iPSC神经元和对照iPSC神经元中内源性CEBPD蛋白水平。(D)相关分析表明CEPBD公司mRNA水平与SNCA公司iPSC神经元的mRNA水平[每百万读数（RPM）]（等式：是的=?0.4196*十+43.28分；P=0.0014）。(E)Western印迹检测CEBPD和SNCA在CEBPD过度表达的SH-SY5Y细胞中的表达*P<0.05**P<0.01****P<0.0001。用未配对的双尾比较t测试。

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组蛋白H3蛋白（H3K27ac）第27个赖氨酸残基的乙酰化和组蛋白H3蛋白（H3K4me3）第4个赖氨酸残基的三甲基化与基因表达水平高度相关(24).H3K27ac也是确定活性增强子的有效标记物(25).因此，我们进行了H3K27ac和H3K4me3芯片分析，以检测所有细胞的活性SNCA公司监管要素。作为THAP1^+/?由于自身调节功能，SH-Y5Y细胞株仍表达接近正常水平的野生型THAP1蛋白(20)，我们生成塔帕1敲除SH-SY5Y细胞系（shTHAP1），其中THAP1蛋白降低到30%（图S2B）。同样，在shTHAP1细胞系中也观察到SNCA的表达降低（图S2C）。显著降低H3K27ac改性SNCA公司与对照细胞系（shControl）相比，在shTHAP1细胞系中发现启动子和潜在增强子，包括增强子1（En-1）和增强子2（En-2）(图2A).变化SNCA公司增强子的活性强于其启动子的变化（图S2D）。同样减少了H3K27ac和H3K4me3的改装SNCA公司与对照组相比，THAP1患者的iPSC神经元中也发现启动子和增强子(图2B).

因为THAP1在SNCA公司增强剂(图2A)，它对SNCA公司增强子的活性可能是通过SNCA公司，CEBPD（CCAAT/增强子结合蛋白delta）(17)因为RNA-seq和Western-blot分析显示，与对照组相比，THAP1患者iPSC神经元中CEBPD的表达显著增加(图2C).以下数据进一步支持了这一假设：（1）iPSC神经元SNCA的表达水平与CEBPD的表达水平呈负相关(图2D);（ii）THAP1与CEBPD公司启动子（图S2E）和CEBPD结合到SNCA公司促进剂和促进剂(图2A);（iii）击倒塔帕1诱导了CEBPD的表达，增强了CEBPD的结合活性SNCA公司启动子（图S2、F和G）；CEBPD过表达确实抑制了SH-SY5Y细胞内源性SNCA的表达(图2E).

THAP1的相互作用伙伴CTCF调节SNCA表达

接下来，我们想知道THAP1的相互作用伙伴是否也是SNCA的转录调控因子。因此，我们进行了串联亲和纯化和质谱（TAP-MS）分析，以分离出THAP1的相互作用伙伴，在TAP-MS中，我们在人胚肾（HEK）细胞中过度表达flag标记的THAP1蛋白，并用抗旗琼脂糖凝胶将THAP1蛋白及其相互作用伙伴拉低。最后，我们进行了质谱分析以鉴定所有这些蛋白质。利用TAP-MS分析，我们共分离出149个与THAP1强相互作用的蛋白质₂>15条）(图3A).串蛋白-蛋白质相互作用网络分析将这些蛋白质分为五种功能复合物(图3B)例如RNA聚合酶II（Pol II）–相关因子1（PAF1）复合物（PAF1C）和染色质组装复合物，包括CTCF(图3B)，在调节mRNA表达方面具有潜在的功能。Western blot分析证实了THAP1与其相互作用伙伴之间的相互作用，如CTCF（图S3A）。芯片序列显示CTCF与SNCA公司启动子和靠近SNCA公司En-2标准(图2A).击倒CTCF公司下调SNCA的表达，而CTCF的过度表达导致SNCA的上调(图3C以及图S3B）。我们也被淘汰了PAF1在PAF1C的关键成分SH-SY5Y中，未观察到SNCA的表达变化(图3D以及图S3C）。所有这些数据表明，THAP1的相互作用伙伴CTCF，而不是PAF1，是SNCA公司基因。进一步的芯片qPCR分析表明，敲除CTCF并不影响其活性SNCA公司启动子和增强子（图S3D），表明CTCF调节SNCA公司表达可能通过改变增强子-启动子接触，因为它有调节增强子-启动子相互作用的功能(26).

图3.THAP1的相互作用伙伴CTCF调节SNCA的表达。

(A)点图显示TAP-MS分析确定的THAP1的相互作用伙伴，CTCF和THAP1用红色标记。LogFC，log fold change。(B)stringdb网络分析注释了THAP1交互伙伴的功能复合体。(C)Western-blotting法检测大鼠CTCF和SNCA蛋白水平CTCF公司敲除（左）和CTCF过度表达（右）SH-SY5Y细胞。黑色箭头表示CTCF的一个小亚型。(D)Western印迹检测PAF1和SNCA蛋白水平PAF1敲除SH-SY5Y细胞。

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SNCA公司内含子4中的增强子与其启动子接触并调节其表达

由于THAP1通过控制其增强子和启动子活性来调节SNCA的表达，我们接下来想知道这些增强子是否真的与SNCA公司启动子调节其表达，并观察CTCF是否调节其表达SNCA公司增强子启动子接触。因此，我们进行了圆形染色体构象捕获和测序（4C-seq）分析SNCA公司以启动子为观察点（VP）。我们观察到SNCA公司En-2区及其启动子(图4，A和B).其他地区，如SNCA公司En-1和毫米1启动子，也显示与SNCA公司用Basic4C包分析4C序列数据时的启动子(图4B) (27).因为CTCF对两者都有约束力SNCA公司发起人和SNCA公司增强剂En-2(图4A)，我们调查了它是否也介导了SNCA公司增强子-启动子相互作用。击倒CTCF公司降低了VP之间的接触频率(SNCA公司启动子）和位于SNCA公司基因(图4，A和C).因此，CTCF调节SNCA公司增强子启动子环。

图4.SNCA公司内含子增强子调节其表达。

(A)野生型和CTCF中SNCA 4C-seq原始读数的分布^?/?SH-SY5Y小区（车道1和2）。CTCF芯片序列检测其在SNCA公司吉恩（第三跑道）。这个SNCA公司启动子区设为VP。红色箭头表示SNCA公司在野生型细胞中与VP强烈接触的En-2区，而这种相互作用在CTCF中消失^?/?SH-SY5Y细胞（En-1和En-2表示两者的位置SNCA公司内含子增强子。(B)Basic4C包用于分析4C序列数据。红色箭头表示与VP接触的区域(SNCA公司发起人）（从左到右：SNCA公司En-2标准，SNCA公司En-1，和毫米1发起人）。(C)4C-ker包分析了SNCA公司野生型和野生型启动子及其内含子4区（包括两个增强子）CTCF公司击倒(CTCF公司^?/?)SH-SY5Y细胞（每个样本至少进行两次生物复制）。黑色箭头和短黑线都显示了与SNCA公司启动子（4C ker分析默认设置：K=10，q_值=0.01）。(D)示意图显示了克隆载体的策略，以表征其作用SNCA公司增强子（En-1和En-2）对其启动子的调控作用(SNCA公司pro）活动。一个与基因组无关的区域作为阴性对照（Con）（top）。荧光素酶报告分析测定的作用SNCA公司增强剂调节其启动子活性（底部）。(E)示意图展示了使用CRISPR-Cas9技术击倒的策略SCNASH-SY5Y细胞中的En-1或En-2（顶部）。Western blotting（底部）显示En-1或En-2基因敲除SH-SY5Y细胞中SNCA蛋白水平。(F)统计分析显示SNCA蛋白水平SNCA公司En-1或En-2基因敲除SH-SY5Y细胞***P<0.001****P<0.0001。用未配对的双尾比较t测试。

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进一步验证SNCA公司内含子增强子，我们亚克隆了SNCA公司En-1和En-2片段进入卢克⁺基因分别在pGL3基本载体中表达卢克⁺基因是由SNCA公司启动子核心(图4D).与基因组无关片段（对照组）相比SNCA公司En-1和En-2片段可以上调细胞的活性SNCA公司启动子，而En-2片段的功能强于En-1片段(图4D).接下来，我们击倒了SNCA公司在SH-SY5Y细胞中的En-1和En-2，观察这些增强子在多大程度上控制SNCA的表达（图S4，A和B）。击倒SNCA公司En-1显著降低了约20%的表达，而敲除En-2则显著抑制了其75%的表达(图4、E和F).我们还把SNCA公司En-1在SK-N-AS神经母细胞瘤细胞系中的表达SNCA公司En-1失活（图S4C）。出乎意料的是，我们没有观察到在这个细胞系中敲除其En-1区域后SNCA的任何表达变化（图S4C）。这些数据表明SNCA公司增强子可以调节其表达，但只有当它们被激活时。这个SNCA公司En-2对SH-SY5Y细胞SNCA的表达起主导作用。

谱系特异性SNCA公司增强子在神经发育过程中控制其表达

接下来，我们试图知道人类是否被激活SNCA公司增强子与它在神经元和大脑中的表达有关。我们首先用H3K27ac芯片序列分析法分析了这些增强子在iPSCs神经元分化过程中的激活。我们观察到SNCA公司En-2呈现细胞谱系依赖性改变(图5A以及图S5A）。例如，它在iPSC和iPSC衍生的神经前体细胞（iPSC-NPCs）中失活，但在iPSC神经元中中度激活。但是在大脑皮层和小脑SNCA公司tg大鼠，这个内含子增强子区域高度激活并扩展超过30kb形成增强子簇（定义为团内），类似于超增强子(图5A以及图S5B）(28,29).进一步的芯片分析揭示了转录因子P300在该区域的富集（图S5C），人类额叶皮质的总RNA序列分析检测到该区域（图S5B）中增强子RNA（eRNA）的表达，这进一步支持了这些内含子增强子簇作为超增强子的特性(30).人类身上类似的增强剂簇SNCA公司基因和老鼠Snca公司分别在人和大鼠脑中观察到基因（图S5、D和E）(31).此外，下游区域SNCA公司基因也显示了细胞谱系依赖性的变化，并在大脑中形成了增强子簇（定义为图5A).

图5.世系依赖激活SNCA公司增强子与其表达和帕金森病风险有关。

(A)H3K27ac修饰人的研究现状SNCA公司iPSCs、iPSC衍生神经前体细胞（iPSC-NPC）、iPSC神经元、额叶皮质中的基因SNCA公司tg大鼠（大鼠皮质）和小脑SNCA公司tg大鼠（大鼠小脑）（顶部）。点图显示PD风险相关的SNP在SNCA公司GWAS数据的meta分析。橙色圆点表明snp与PD风险有着非常高的关联[?日志₁₀(P值）>30]（底部）。簇间和簇内表明增强子簇的下游SNCA公司基因和内含子增强子簇。(B)RNA-seq分析法测定SNCA在不同细胞和组织中的相对表达水平。

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同时激活SNCA公司增强子，其表达水平相应提高(图5B).在iPSCs和iPSC-NPCs中观察到非常低的SNCA水平，而在iPSC神经元中则有中度SNCA表达。由于hSNCA在不同SNCA转基因大鼠系中的表达水平不同(图1F)因此，我们分析了SNCA公司人脑中的mRNA。SNCA在人小脑和额叶皮质有极高的表达水平(图5B).这些数据进一步表明SNCA公司增强子可能是神经元和大脑中SNCA表达增加的原因。全基因组关联研究（GWAS）数据meta分析显示，snp与PD风险的关联度最高[?日志₁₀(P值）>30]富集在SNCA公司（簇内和簇间图5A，底部）(32).由于这些增强子区域可以调节SNCA的表达，这些区域内PD风险相关的snp可能会影响增强子的活性和SNCA的表达，从而导致散发性PD风险。

SNCA公司内含子增强子簇主要控制SNCA在脑内的表达

接下来，我们想知道内含子增强子簇是否也主要调节SNCA在大脑中的表达，如SNCA公司En-2区调控多巴胺能SH-SY5Y细胞SNCA的表达(图4、E和F).为此，我们要剔除这些内含子增强子簇（团内：一个包括SNCA公司人类的En-1到En-2）SNCA公司我们的基因SNCA公司转基因大鼠模型(图6A).为了排除增强子敲除过程中拷贝数的改变/重排，我们分析了人类的拷贝数SNCA公司我们两个不同人类的基因SNCA公司转基因大鼠系(图1F)使用全基因组测序数据（测序深度相同）。我们观察到人类的拷贝数SNCA公司基因输入SNCA公司复制的大鼠数量超过10倍SNCA公司tg-L大鼠（图S6A）。我们还观察到SNCA公司tg-L大鼠只有人类的一个拷贝SNCA公司基因，作为大鼠的阅读强度Snca公司基因（两个拷贝）的强度是人类的两倍SNCA公司同一只大鼠的基因（图S6B）。使用CRISPR-Cas9技术，我们生成了一个SNCA公司EnKO大鼠模型，敲除SNCA公司tg-L大鼠(图6A以及图S6C）。全基因组测序和Sanger测序均证实了DNA断裂点位于引导RNA（gRNA）靶点，并在DNA序列中发现了两个残端SNCA公司分别是恩科大鼠（图S6C）。这些数据证明SNCA公司成功地建立了EnKO大鼠模型。

图6.人类SNCA公司内含子增强子簇主要控制其在大脑中的表达。

(A)示意图显示了gRNAs和人类的位置SNCA公司基因结构SNCA公司tg-L和SNCA公司恩科老鼠。(B)免疫印迹证实hSNCA、rSNCA和tSNCA在不同脑区的表达SNCA公司恩科，SNCA公司tg-L和非tg大鼠(n=每组5只大鼠）。(C)脑组织hSNCA和rSNCA的免疫组化染色SNCA公司tg-L型，SNCA公司EnKO和非tg大鼠(n=每组3只大鼠）。比例尺，2 mm(D)用于扩增全长人类的引物示意图SNCA公司mRNA（长度384 bp）（左）。RT-PCR检测人全长基因的表达SNCA公司信使核糖核酸SNCA公司恩科，SNCA公司tg-L和非tg大鼠（右）(n=每组3只大鼠）。(E)RT-qPCR决定人的表达水平SNCA公司信使核糖核酸SNCA公司恩科老鼠。SNCA公司以tg-L大鼠为对照(n=每组4只大鼠）。(F)H3K27ac和H3K4me3芯片seq揭示了人类组蛋白修饰的状态SNCA公司基因输入SNCA公司tg-L和SNCA公司EnKO大鼠（蓝色箭头：H3K27ac修饰人的下游SNCA公司基因输入SNCA公司恩科大鼠；红色箭头：H3K27ac和H3K4me3对人类启动子的修饰SNCA公司基因输入SNCA公司恩科大鼠；灰色方块表示从人类中删除的区域SNCA公司SNCA-EnKO大鼠基因）。(G)芯片qPCR定量测定组蛋白修饰SNCA公司启动子输入SNCA公司tg-L和SNCA公司恩科大鼠(n=每组4只大鼠）***P<0.001****P<0.0001。用未配对的双尾比较t测试。

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接下来我们检测了rSNCA和hSNCA在SNCA公司恩科老鼠。出乎意料的是，Western印迹分析和免疫组化染色均未检测到hSNCA蛋白SNCA公司恩科大鼠(图6、B和C).由于这两种方法对检测极低水平的靶蛋白不敏感，因此我们分析了人的mRNA水平SNCA公司在SNCA公司应用RT-PCR和RT-qPCR建立EnKO大鼠模型。两种方法都检测到极低水平的人类SNCA公司信使核糖核酸SNCA公司恩科老鼠与SNCA公司tg-L大鼠（1.49%）(图6，D和E).确认Sanger测序排除了人类突变、异常剪接或外显子跳跃SNCA公司信使核糖核酸SNCA公司恩科大鼠（图S6D）。这些数据表明，敲除内含子增强子簇可以显著降低hSNCA在大脑中的表达。

SNCA公司内含子增强子簇通过释放暂停的RNA-Pol-II调节其表达

增强子II可以通过促进基因的启动、延长、诱导基因的表达。看看SNCA公司内含子增强子簇控制着它在大脑中的表达，接下来我们用H3K27ac和H3K4me3芯片seq和qPCR来检测人类SNCA公司启动子活动SNCA公司恩科老鼠。缺失内含子增强子簇导致人类H3K27ac和H3K4me3修饰减少约50%SNCA公司发起人(图6，F和G).然而，启动子活性的变化与mRNA表达的变化并不匹配，因为人类的SNCA公司剔除内含子增强子簇后，mRNA下降到1.49%(图6E).因此我们想知道内含子增强子是如何调节hSNCA表达的。我们首先用Pol-II和S5磷酸化Pol-II（P5-Pol-II）芯片序列检测人类转录起始和延伸SNCA公司野生型和SNCA公司En-2 KO SH-SY5Y细胞(图7A).我们观察到Pol II在整个SNCA公司野生型SH-SY5Y细胞中的基因与SNCA公司En-2 KO SH-SY5Y细胞(图7A)，表示下降SNCA公司转录延伸SNCA公司En-2 KO SH-SY5Y细胞。P5-Pol-II在SNCA公司启动子输入SNCA公司与野生型SH-SY5Y细胞相比，检测到En-2ko-SH-SY5Y细胞(图7A);这些数据表明SNCA公司基因输入SNCA公司En-2ko-SH-SY5Y细胞略高于野生型SH-SY5Y细胞。在额叶皮质也观察到类似的变化SNCA公司tg-L和SNCA公司恩科老鼠。PolⅡ在SNCA公司基因体在SNCA公司tg-L皮质与SNCA公司恩科皮层，而SNCA公司EnKO大鼠皮层P5-Pol-II和负延伸因子E（NELFE）含量较高，后者是NELF复合物的重要组成部分(33)，与SNCA公司tg大鼠皮层(图7B以及图S7，A至C）。此外，芯片qPCR显示PolⅡ与人外显子2和4的结合活性更强SNCA公司基因SNCA公司tg-L大鼠皮质与SNCA公司EnKO大鼠皮层（图S7A）。所有这些数据都有力地支持了SNCA公司内含子增强子(SNCA公司En-2单独或整体SNCA公司导致RNA Pol II暂停在SNCA公司启动子，导致转录延长和SNCA表达降低(图7C图S7D）。因此SNCA公司内含子增强子簇主要通过促进暂停RNA Pol II的释放和转录延长来调节SNCA的表达。

图7.人类SNCA公司内含子增强子簇促进暂停RNA PolⅡ的释放。

(A)芯片序列显示RNA Pol II，丝氨酸-5磷酸化Pol II（P5 Pol II）和NELFE在野生型和SNCA公司En-2 KO SH-SY5Y细胞。(B)芯片序列显示了Pol II，P5 Pol II，NELFE和丝氨酸-2磷酸化Pol II（P2 Pol II）的结合谱SNCA公司tg-L大鼠皮层和SNCA公司恩科大鼠皮层。（A和B）蓝色箭头表示Pol II在人类身上的结合信号SNCA公司基因体。红色箭头显示P5 Pol II在SNCA公司启动子输入SNCA公司En-2 KO SH-SY5Y细胞和SNCA公司EnKO大鼠皮质与野生型SH-SY5Y和SNCA公司tg-L大鼠皮层。黑色箭头表示NELFE结合信号在SNCA公司恩KO大鼠的皮层比在SNCA公司tg-L皮质。(C)示意图显示了人类的结构和转录调节器SNCA公司野生型基因(SNCA公司tg-L）和in增强子簇基因敲除(SNCA公司恩科）条件。人类SNCA公司启动子与许多转录因子结合并与其内含子增强子（增强子）接触。启动子与增强子的接触促进PolⅡ暂停的释放和转录延长（top）。敲除人类的内含子增强子簇（增强子）SNCA公司基因失去了增强子和启动子之间的联系，增加了启动子上NELF的富集，导致RNA Pol II暂停（底部）。

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讨论

我们发现了两种新的人类转录调节因子SNCA公司基因，DYT6肌张力障碍基因产物THAP1及其相互作用伙伴CTCF。THAP1调节SNCA公司启动子和增强子通过直接和间接途径，而CTCF介导增强子-启动子相互作用。在神经元发育过程中SNCA公司内含子增强子En-2呈现细胞谱系依赖性活动。在大脑中，这种增强子扩张并形成增强子簇，主要通过促进RNA Pol II pause的释放来上调SNCA在大脑中的表达，而敲除这些内含子增强子簇会显著降低其在体内大脑中的表达。

SNCA的表达降低可能与DYT6肌张力障碍的表型有关，但它很可能不是导致DYT6肌张力障碍表型的关键节点。完全击倒Snca公司小鼠纹状体多巴胺减少，多巴胺依赖性运动反应减弱(34,35).同样，在我们的DYT6大鼠中，观察到了运动活动缺乏和苯丙胺诱导的纹状体胆碱能中间神经元放电频率的异常(20).然而，SNCA公司不是DYT6肌张力障碍中发现的唯一一个失调基因塔帕1突变主要通过其靶点SP1引起基因表达的改变(20).此外，除DYT6型肌张力障碍外，其他类型原发性肌张力障碍的SNCA表达变化可能并不常见。在TAF1/DYT3肌张力障碍患者的成纤维细胞和分化为神经元的iPSC没有显示SNCA的异常调节(36).此外，TorsinA敲除小鼠的脑组织也没有显示CEBPD或SNCA的表达变化(37).

一些研究证实高水平的野生型SNCA蛋白是导致PD发病的一个因素。对其转录调控特性的研究有助于我们寻找新的治疗靶点。在这项研究中，我们发现了两个新的转录调节因子SNCA公司基因，THAP1和CTCF。体外和体内数据都支持THAP1在调节SNCA公司分别在神经元细胞和大脑中。THAP1可以直接调节SNCA公司启动子活性或通过CEBPD间接调节其增强子活性。CTCF是迄今为止发现的第一个转录因子SNCA公司基因结构，如增强子启动子环。

在这项研究中，我们检测到人类的两个增强子簇SNCA公司基因在脑内并证明了其在体内的功能，内聚集体（位于内含子4区，包括SNCA公司En-1和SNCA公司En-2）和簇间体（位于SNCA公司基因）(图5A).GWAS荟萃分析确定的PD风险相关snp在这两个增强子簇区得到了丰富。虽然这些snp的确切作用目前还不清楚，但它们可能上调内源性snp的表达SNCA公司或者通过修改增强子活性(38)或者改变增强子和启动子的接触(39)从而有助于PD的发病机制。例如，位于簇间区域的PD风险最高的rs356182导致人类额叶皮质SNCA表达增加(40).更高级别的SNCA公司与对照组相比，在携带风险snp的PD患者的黑质（SN）中观察到mRNA的表达，这些snp位于集群间，如rs356165、rs356219和rs11931074(41,42).与对照组来源于iPSC的神经元相比，具有PD风险相关snp的人iPSC源性神经元（rs356168）表达了更高水平的SNCA(9).PD风险-在SNCA公司启动子（SNCA-Rep1）也可能上调多巴胺能SH-SY5Y细胞和转基因小鼠脑内SNCA的表达(8,43).然而，这种改变在其他一些使用不同组织的研究中无法复制。研究发现，携带这种病毒的帕金森病患者血液中的mRNA水平降低或不变SNCA公司-Rep1变体或其转基因小鼠的血液(41,43).在患者的颞叶皮层中，携带了来自SNCA公司-mRNA没有增加，反而减少了(44).所有这些观察结果可能表明携带snp的PD患者SNCA表达的组织依赖性变化，SNCA的表达增加可能主要发生在PD患者的受累脑区，如中脑或SN。总的来说，增加了SNCA公司-mRNA主要在PD患者的中脑或SN中观察到(45,46)而在其他组织/区域，如颞叶/额叶皮质或脑脊液（CSF）中，SNCA的蛋白水平甚至下降，这一点在许多不同的研究中都有报道(44,45,47–49).同样，在伴有LBs或多系统萎缩的痴呆患者中也观察到CSF SNCA蛋白水平的降低(47).脑脊液SNCA水平降低可能是由于脑脊液摄取SNCA到神经元和少突胶质细胞的速率增加(47).然而，所有这些观察结果都支持组织依赖性的表达改变SNCA公司在帕金森病患者中，帕金森病风险相关的snp在调节中的作用SNCA公司在不同组织中的表达，以及在帕金森病的发病机制中的表达，需要进一步的系统描述。

在这项研究中，我们观察到人类SNCA公司内含子增强子在人类iPSCs的神经元分化过程中也呈现谱系依赖性激活。在分化过程中，许多基因是通过组织和发育阶段特异性增强子及其同源启动子之间的相互作用来启动的(50).然而，增强子在分化过程中如何控制启动子的转录周期，目前还不清楚。增强子可以调控转录起始，在分化过程中，基因的表达主要通过增强子来调控(50).在这项研究中，我们发现神经元分化相关的促进剂可以促进暂停的Pol-II从其启动子释放，通过该启动子主要调节SNCA的表达。促进RNA-Pol-II暂停释放的增强子也被报道用于其他一些基因(51);一个潜在的机制可能是增强子表达eRNA，促进NELF复合物的释放，从而促进转录延长(52).表达SNCA公司人脑中的eRNA也支持其内含子增强子簇在促进RNA Pol II释放中的作用。作为人类SNCA公司增强子在某些细胞/组织中特别被激活，例如在神经元或大脑中SNCA公司增强子介导的PolⅡ暂停释放也可能依赖于细胞系。

由于高水平或突变的SNCA在PD和其他神经退行性疾病的发病机制中的作用，许多动物或人类的治疗研究都假设应用小干扰RNA或短发夹RNA（shRNA）来降低内源性SNCA的水平(53).反义寡核苷酸，如酰胺桥联核酸修饰的反义寡核苷酸也被认为是潜在的治疗靶向SNCA公司基因(54).虽然通过不同方法降低SNCA的表达可以保护hSNCA诱导的神经退行性变(55)，鱼藤酮(56)，或1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(57)此外，还观察到载体或注射本身引起的毒性或炎症反应，以及由于内源性SNCA水平极低而导致多巴胺含量和TH神经元减少等副作用(55–57).类似地，靶向一般转录因子或修饰组蛋白修饰，如H3K27ac(58)作为一种全局性的治疗策略，可能并不会导致帕金森病的整体治疗策略的改变。这个SNCA公司启动子和CRE样增强子直接调控其表达，可作为治疗靶点。使用基于CRISPR-dCas9的技术来修改DNA甲基化或组蛋白修饰SNCA公司据报道，启动子是一种通过SNCA公司培养神经元表达下调(14,59).然而，这些病毒载体治疗的体内和长期治疗效果都是未知的。此外，大脑特异性SNCA的表达受其内含子增强子簇的调控；因此，靶向启动子可能不足以下调SNCA在大脑中的表达。作为人类的转录机器SNCA公司基因及其在脑中的表达水平与培养的神经元不同，利用培养的神经元或iPSC衍生的神经元作为模型系统来研究人类的转录调控SNCA公司基因或帕金森病风险相关单核苷酸多态性的影响需要谨慎解释。

我们的数据和以前的报告都支持SNCA公司En-1在多巴胺能神经元细胞中被特异性激活(19).我们的结果证明敲除激活SNCA公司增强剂（如En-1）在多巴胺能神经元细胞中会适度抑制其表达，但在En-1失活的神经元细胞如SK-N-as细胞中，其缺失并不影响SNCA的表达。基于内含子增强子簇在调节脑组织特异性表达中的作用SNCA公司，有针对性地编辑内含子增强子簇的小区域，例如SNCA公司En-1，利用体内CRISPR-Cas9基因编辑系统适度降低SNCA在脑或多巴胺能神经元中的表达，有望成为一种新的治疗策略，有望预防SNCA在神经退行性疾病中的蓄积。

材料和方法

细胞培养

所有的细胞系在用于实验之前都通过多态性短串联重复位点进行鉴定(20).每3个月定期检测支原体污染。HEK-293[美国型培养收集（ATCC）CRL-1573]和SH-SY5Y（ATCC CRL-2266）细胞购自Sigma-Aldrich（85120602和94030304）（RRID:CVCL U 0045和CVCL U 0019），在含10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的杜尔贝科改良Eagle培养基中，37°C下在含5%CO的增湿空气中培养₂.

shTHAP1 SH-SY5Y细胞系的建立

稳定击落塔帕1在SH-SY5Y细胞中，通过稳定转染THAP1 shRNA表达载体（Sure沉默shRNA质粒KH07515N，QIAGEN）来进行。两种shRNA表达载体用于稳定地敲除SH-SY5Y细胞中的THAP1（靶点1:GacGtatcagaAggAtt；靶点2:GCCTGTAAaggTTTCatt）。实时PCR和Western印迹检测THAP1的表达。用阴性对照shRNA稳定转染对照细胞株（序列：ggaatcttcgatgcatac）。

质粒载体

从HEK-293细胞cDNA中扩增出hTHAP1互补DNA（cDNA）开放阅读框，亚克隆到pcDNA3.1或pcDNA3.1/Flag质粒（Invitrogen）。CEBPD表达载体是从Genscript购买的（OHu17203D；Genscript）。pX330-U6-嵌合β-CBh-hSpCas9是张F.Zhang（Addgene质粒#42230；http://n2t.net/addgene:42230).pSpCas9（BB）-2A Puro（PX459）V2.0是张先生（Addgene质粒#62988）的礼物。pBABE puro是H.Land、J.Morgenstern和B.Weinberg（Addgene质粒#1764；http://n2t.net/addgene:1764).CTCF表达载体是由J.Boehm，W.Hahn和D.Root的礼物pDONR223_CTCF_WT（J.Boehm，W.Hahn，D.Root的礼物；Addgene质粒#81789）扩增其cDNA，并亚克隆到pcDNA3.1/V5tag载体中。所有亚克隆载体均经Sanger测序证实。

iPSCs的产生及向mDA神经元分化的研究

iPSCs的产生和分化为mDA神经元已经在我们以前的出版物中描述过(20).国家研究伦理委员会（卢森堡）已批准开发和研究患者衍生细胞系。简言之，在获得捐赠者书面知情同意的情况下，从皮肤活检中获得天然成纤维细胞。如前所述，维持和培养成纤维细胞(60).患者和对照组的信息均已公布(20).利用Simplicon RNA重编程试剂盒（Merck）对成纤维细胞进行多能性重组。使用HumanOmni 2.5 Exome-8 DNA分析BeadChip（Life&Brain GmbH）进行分子核型分析和身份分析。iPSCs的培养与先前发表的一样(60,61).

根据先前报道的方案，mDA神经元与iPSCs分化(61).NPB27在使用IPSB27培养基之前被首次描述为NPCs(20).在含有1μM嘌呤胺、200μM抗坏血酸和FGF8b（100 ng/ml；蛋白胨，100-25）的N2B27培养基中直接分化NPC。分化8天后，将培养基改为添加0.5μM嘌呤胺和200μM抗坏血酸的N2B27培养基，培养2天。从定向分化的10天到指定的实验时间点（第45天起），向N2B27培养基中添加以下物质：脑源性神经营养因子（10 ng/ml；PeproTech，450-02）、胶质细胞源性神经营养因子（10 ng/ml；PeproTech，450-10），转化生长因子-β3（1ng/ml；PeproTech，100-21）、3′、5′-单磷酸腺苷（500μM；Applichem，A0455）和抗坏血酸（200μM）。

人死后脑组织

根据德国图宾根大学动物护理和使用委员会制定的指南（项目编号：565/2019BO2），已批准使用人脑组织进行实验。冰冻的死后额叶皮质组织取自两名THAP1突变患者（分别为THAP1 p.S21F和p.R29Q突变）和三名神经正常对照个体(20).

CRISPR-Cas9敲除CTCF公司和PAF1

击倒CTCF公司和PAF1采用CRISPR-Cas9技术(62).gRNA是由CRISpick选择的(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public).biomers合成的gRNA寡聚体(www.biomers.net)退火并亚克隆到pX459载体中。pX459/gRNA与pBabe空载体（比例10:1）共转染SH-SY5Y细胞。转染24小时后，用嘌呤霉素（终浓度2μg/ml）筛选细胞48h。存活细胞在10cm培养皿中传代培养至单克隆形成。用Sanger测序和westernblot筛选阳性细胞克隆，验证靶蛋白表达。表S1列出了所有的gRNA序列和基因型引物。

CRISPR-Cas9敲除SNCA公司En-1和En-2

SNCA公司En-1和En-2基因敲除采用CRISPR-Cas9系统。两个gRNAs目标侧翼SNCA公司En-1标准(SNCA公司gRNA-1和gRNA-1；表S1）或SNCA En-2(SNCA公司En-2）(SNCA公司En-2 gRNA 1和gRNA 2；表S1）由CRISPick设计(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)并亚克隆到pX459载体中。将两对gRNAs和pBabe共转染SK-N-AS或SH-SY5Y细胞（比例为1:1:0.2）敲除SNCA公司转染后24小时，用嘌呤霉素（终浓度2μg/ml）筛选细胞48h。存活细胞在10cm培养皿上传代培养，直至形成单克隆。用PCR方法对单个克隆进行基因分型。阳性和阴性基因型PCR引物见表S2。

动物研究

所有动物（大鼠）实验均由当地伦理审查委员会（Regierungspr?sidium Tübingen）（HG6/14、HG03/20G和HG01/21G）批准。动物实验程序是根据图宾根大学动物护理和使用委员会制定的指导方针进行的。所有的动物研究都是按照“3R”原则（替代、减少和精炼）进行的。对于蛋白质分析、RNA分析和免疫组化染色，每组至少使用3至5只动物（3个月大）。所有实验，包括蛋白质分析、RNA-seq和ChIP-seq，都是用3个月大的雄性大鼠进行的。本研究建立了以下动物模型。

hTHAP1型转基因大鼠模型（hSNCA-tg）

创造人类塔帕1转基因大鼠模型塔帕1用以下PCR引物从人基因组DNA中扩增出12kb基因：前向引物：cctcatgatggctttgagt；反向底漆：aagccaagtagaattcagg。用KpnⅠ和SalⅠ限制性酶将PCR产物亚克隆到pUC19载体中。经Sanger测序验证阳性克隆序列后，对THAP1基因片段进行消化纯化。高质量塔帕1将DNA片段直接注入大鼠受精卵原核内，制备hTHAP1转基因大鼠模型。在mRNA和蛋白质水平上分析hTHAP1的表达。

人SNCA和hTHAP1双转基因大鼠模型（SNCA/THAP1-tg）

这个hSNCA公司/hTHAP1型双转基因大鼠模型是由我们以前发表的人类杂交产生的SNCA公司tg大鼠(11)和新生的人类塔帕1tg大鼠。

人SNCA内含子增强子簇敲除（SNCA-EnKO）大鼠模型

这个SNCA公司利用CRISPR-Cas9系统建立内含子增强子簇基因敲除大鼠模型。两个gRNAs是针对大的内含子簇区（约48.6kb）的两端设计的，其中包括SNCA公司En-1和SNCA公司CAACTACT2地区：CAACT2。将两个合成的gRNAs与单链寡核苷酸模板和Cas9蛋白一起注入大鼠受精卵的原核。基因分型采用阳性PCR和阴性PCR分析。使用针对敲除后残余物两端的引物（正向引物：ggccaaatgactaatgagggg；反向引物：gaacttggctgatcatctgagtccattc）进行阳性PCR。使用针对gRNA2位点上游和下游测序的引物（正向引物：cgtatatgaggcttaggtgc；反向引物：gaacttggctgatctgagtccattc）进行阴性PCR。

免疫印迹

德国图宾根大学医院伦理委员会批准使用人脑组织和iPSC分化的mDA神经元进行蛋白质分析。如前所述，进行Western印迹(20).简而言之，培养细胞在放免沉淀试验（RIPA）缓冲液中裂解[1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，150 mmol NaCl，50 mmol tris（pH 8.0）和1×蛋白酶抑制剂]。在用双辛酸试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质浓度后，用SDS凝胶分离蛋白质样品，并将其印迹到一个亚硝基细胞膜（Millipore）上。用一级抗体（不同抗体的工作浓度见表S2）和二级抗体[1:15000浓度；IRDye 800CW山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）或IRDye 680RD山羊抗鼠IgG（H+L）]孵育后，在Odyssey Fc成像系统（Li Cor）下观察印迹膜。每个免疫印迹至少重复三次。

免疫组织化学染色

免疫组织化学染色如前所述(63).3个月大的雄性大鼠的大脑被4%多聚甲醛磷酸缓冲盐水（PBS）经心灌注固定，然后在4℃下用同样的固定剂固定过夜。半脑用石蜡包埋，切片。采用DAB（3,3′-二氨基联苯胺）染色法对SNCA-tg大鼠和SNCA-EnKO大鼠的hSNCA和rSNCA进行染色。具体来说，整个过程是在室温下进行的。用0.5%硼氢化钠阻断脑切片内源性过氧化物酶活性，然后在含0.4%tritonx-100的tris缓冲盐水中进行切片渗透。在一级抗体抗SNCA（抗hSNCA，1:250；抗rSNCA，1:500）中孵育过夜，然后用生物素化山羊抗兔，稀释1:1000（载体实验室）进行二级抗体染色。然后，切片用亲和素-生物素复合物（Vector Laboratories，BA-1000）处理，并暴露于DAB-H₂O₂（0.01%DAB和0.001%过氧化氢）直到形成合适的染色强度。

荧光素酶报告分析

荧光素酶报告分析如前所述(64).完整的SNCA公司启动子区（10.7kb）(23)经PCR扩增，亚克隆到pGL3空载体中。在pGL3载体与pcDNA3-THAP1或pcDNA3空载体共转染48小时后，用双荧光素酶报告系统（Promega）在Mithras光度计（Berthold Technologies）中孵育，测定萤火虫和肾素荧光素酶的活性。这个托尔1A启动子被用作阳性对照，因为THAP1可以抑制其活性托尔1A发起人(64).所有实验至少在五个独立的重复中被证实。

检测SNCA公司增强子和启动子，核心启动子区域（1.34kb）的SNCA公司整个基因被扩增出来SNCA公司启动子用引物AgcTagCaAggCttTtcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTcTc。这个SNCA公司En-1区[1560个碱基对（bp）；正向引物：caaactcacagtagacaa；反向引物：aatttcctggatgctcgtag]，SNCA公司从人基因组DNA中扩增出En-2区（1496bp；正向引物：taaaggactggaagtt；反向引物：aaaaccatccaggatttcc）和阴性对照区（1504 bp；正向引物：aatgcatgagttgt；反向引物：tctttcccatggttct）并亚克隆到pGL3/SNCA公司核心启动子载体。携带SNCA公司将启动子和增强子与pRL载体（Promega）共转染SH-SY5Y细胞，分析其相互作用SNCA公司促进剂和增强子。

核蛋白提取

从HEK细胞、SH-SY5Y细胞或脑组织中提取的核蛋白用于分析THAP1蛋白水平或用于TAP-MS实验。简要地，用缓冲液A[10 mM Hepes（Sigma-Aldrich）、1 mM EDTA（Applichem）、0.1 mM EGTA（Sigma-Aldrich）、10 mM KCl（Carl Roth）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF；Sigma-Aldrich）、磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3（1μg/ml；Sigma-Aldrich）、1 mM二硫苏糖醇（DTT；Merck）收集，以及完整的蛋白酶抑制剂（1μg/ml；Roche）]。孵育15分钟后，将NP-40（罗氏）加入0.1%的终浓度，使细胞膜破裂。10000离心后g在4℃下5分钟，去除上清液（细胞质部分），将细胞核在缓冲液C（20 mM Hepes、0.2 mM EDTA、0.1 mM EGTA、25%甘油（Carl Roth）、420 mM NaCl（默克公司）、1.5 mM MgCl的缓冲液中重新悬浮₂（Sigma-Aldrich）、1 mM PMSF、磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3（1μg/ml）、1 mM DTT和完全蛋白酶抑制剂（1μg/ml）），并在智能混合器上在4°C下旋转20分钟。10000离心后g在4℃下5分钟，收集含有核蛋白的上清液。

串联亲和纯化与质谱分析

TAP-MS按先前报告执行(65).在过度表达Strep/FLAG标记的THAP1蛋白的HEK-293细胞中进行TAP。如前所述提取核蛋白，并用抗旗M2琼脂糖亲和凝胶（Sigma-Aldrich）培养。在培养过程中，每毫克核提取物中加入300 U苯甲酸酶核酸酶（Sigma-Aldrich），以干扰DNA或RNA介导的相互作用。用胰蛋白酶处理旗肽洗脱的蛋白质溶液，进行定量串联质谱分析（液相色谱-串联质谱）。原始数据通过建立相应样品特定碎片离子的峰面积强度比值来量化。每组（空载体组和野生型THAP1组）重复5次。

芯片和测序

芯片样品制备和高通量测序如前所述(20).对于脑组织，冷冻的脑组织被解冻并切成不到1毫米^三件。将含有1%甲醛的PBS（Thermo Fisher Scientific）加入交联组织15分钟，加入甘氨酸，再孵育5分钟，离心收集组织。对于细胞样品，直接将甲醛加入培养基中，使其交联至最终浓度为1%，并在室温下孵育10分钟。将甘氨酸添加到0.125m的最终浓度并孵育5min后，收集细胞。使用Covaris S220将细胞颗粒/组织颗粒在RIPA缓冲液[10 mM tris HCl、1 mM EDTA、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1%NP-40和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（pH 8.0）]中超声处理至200至500 bp。离心后，染色质与抗体珠复合物一起培养，用山羊抗兔IgG/小鼠IgG磁珠（Thermo Fisher Scientific）孵育抗体1天制备。染色质和抗体珠复合物孵育过夜后，用低盐缓冲液、高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和TE缓冲液洗涤复合物。芯片DNA-蛋白质复合物从珠子中洗脱出来，连夜分离。最后用PCR纯化试剂盒（QIAGEN）提取芯片DNA。使用Illumina的NEB Ultra II DNA文库准备试剂盒（NEB，E7103L）至少使用5 ng免疫沉淀DNA进行文库制备。下一代测序是在Illumina NextSeq500/NovaSeq 6000系统上使用75/100 bp单端高输出测序试剂盒完成的。

染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应

利用芯片qPCR对芯片结果进行定量分析。如前所述，使用QuantiTect PCR试剂盒（QIAGEN）执行芯片qPCR(64).芯片输入样本用于计算芯片结合信号（作为输入）。作为阴性对照。每个实验至少重复三次。用于芯片qPCR的引物如表S3所示。为了分析RNA Pol II暂停，SNCA公司用启动子引物检测Pol-II在启动子区的结合情况，并与Pol-II结合SNCA公司外显子2和SNCA公司第4外显子检测Pol-II结合SNCA公司基因体。

mRNA序列和总RNA序列

按照制造商的方案，使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）或RNeasy脂质组织迷你试剂盒（QIAGEN）分离总RNA。用于文库制备的RNA样品具有较高的完整性（RNA完整性数>9）。对于mRNA序列，共有100 ng总RNA经过聚腺苷酸富集，并使用产生的mRNA和用于Illumina（NEB，#E7760L）的NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒构建cDNA文库。在NovaSeq6000（Illumina）上对库进行测序，每个读取深度约为2000万次。文库准备和测序程序由同一个人执行，目的是尽量减少技术批处理的影响。

反转录PCR

表达水平SNCA公司信使核糖核酸SNCA公司如前所述，用RT-PCR和RT-qPCR分析EnKO大鼠(66).简言之，用RNeasy脂质组织迷你试剂盒（QIAGENE）提取脑组织总RNA，并用Omniscript RT试剂盒反转录成cDNA。全人类SNCA公司以第2外显子和第3′端非翻译区（3′UTR）为靶点的引物扩增cDNA转录本SNCA公司基因（正向引物：aagcagcaggaaagcaaaa；反向引物：acatctgcagcagatca）。人的RT-qPCRSNCA公司用QuantiTect-PCR试剂盒（QIAGEN）检测mRNA表达，引物靶向基因外显子5和3′UTRSNCA公司基因（正向引物：ctgtggatcctgagaatgag；反向引物：caagaactgggagagaaga）。以大鼠管家基因actin作为内对照（正向引物：agagagattackgccctg；反向引物：ccacaatchacacacagtta）。

圆形染色体构象捕获及测序

4C seq如前所述执行(27)经过以下修改：（i）NlaⅢ（新英格兰生物实验室）和BfaⅠ（thermofisher Scientific）分别被选为第一和第二限制酶；（ii）在生成用于测序的4C序列库之前，观察点的4C模板（VP:SNCA公司启动子）用特异性引物（正向引物：acgaatggtgtgggcaccg；反向引物：CCTCTCTTGGGCCCCTTCTG）进行6个周期的PCR扩增。最终的4C-seq文库由24个周期的PCR产生，使用索引引物（P5和P7；转发：aatgatacgCGACCGATCCTCTCACTTCTCTCTCTCCTCACGACGCCTCTTCGCATCTNNNNNNCACGGATGGATGGATG；反面：caagcaagagagcatagaggatgcgtcctctctctcgtag；NNNNNN：条形码序列用于隔离不同样本的读取）。下一代测序是在Illumina NextSeq500系统上使用150 bp单端高输出测序试剂盒完成的。

数据分析

芯片序列数据分析

简言之，使用Bowtie2将芯片序列原始读数与hg19基因组或rn6基因组组装对齐。只有唯一映射到基因组的读数才用于进一步分析。使用MACS2分析芯片序列峰值调用，使用deeptools（3.3.2版）和samtools（1.9版）包将Bam文件转换为coverage bigWig文件，并使用integrated Genomics Viewer（IGV）浏览器（2.12.2版）查看Bam文件。

RNA序列数据分析

使用QoRTs（v1.2.37）对fastq文件中RNA序列数据的质量进行评估，以确定平均质量较低的测序周期、适配器污染或来自PCR扩增的重复序列。使用HISAT2（版本2.2.1）对读数据进行比对，允许有间隙的比对来解释针对由Ensembl智人GRCh37组成的定制基因组的拼接，并且使用samtools（v1.1）分析比对质量，并在IGV（版本2.12.2）中进行目视检查。使用featureCount（v3.18.1）获得所有基因的标准化读取计数。使用deeptools（版本3.3.2）和samtools（版本1.9）包将Bam文件转换为coverage bigWig文件，并使用IGV浏览器（版本2.12.2）查看Bam文件。

4C序列数据分析

通过条形码序列将原始读取数据分成单独的样本FastQ文件。通过保留VP特异性PR扩增子（ggagggggtgtgctgc）对每个样本的原始读数进行筛选，去除属于VP限制性片段的核苷酸序列，然后使用Bowtie2将其映射到hg19基因组组件上。只有唯一的映射读数才用于进一步的Basic4C分析(27)和4C-ker包(67).映射的原始读取被保存为bedgraph文件，并使用IGV浏览器（版本2.12.2）查看。

统计分析

本研究中的所有数据均采用双尾不成对分析t两组比较后进行测试。使用Prism软件10.0（GraphPad软件，加利福尼亚州拉霍拉市）进行统计分析。当*P≤0.05**P≤0.01***P≤0.001，以及****P≤0.0001。