酵母杂交--植物抗逆性研究好工具

【字体: 时间:2022年11月24日 来源:Takara

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  酵母杂交作为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA之间相互作用的方法,因为其广谱适应性、真实性、实验操作简单、成本相对较低、通量大等特点也逐渐成为植物研究的重要工具,被广泛应用于植物如何感受和响应逆境胁迫的研究中。

众所周知,植物需要应对持续变化的环境,包括经常性的不利于植物生长和发育的胁迫环境。这些不良环境包括生物胁迫(如病原体感染)和非生物胁迫(例如干旱、高温、冷害、营养匮乏、盐害以及土壤中铝、砷、镉等有毒金属毒害),不仅影响农作物品质,还对农业生产产生十分不利的影响,植物如何感受和响应逆境胁迫是一个根本性的生物学问题。因此,开展逆境胁迫的基础研究、提高植物抗逆性显得尤为重要。

酵母杂交作为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA之间相互作用的方法,因为其广谱适应性、真实性、实验操作简单、成本相对较低、通量大等特点也逐渐成为植物研究的重要工具,被广泛应用于植物如何感受和响应逆境胁迫的研究中。

【应用案例】

生物胁迫-棉花对尖孢镰刀菌的免疫反应

棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的、发生在棉花的病害,是棉花生产中危害最严重的病害之一,曾被称为棉花的“癌症”之一。对这种胁迫的适应涉及到复杂的感知、信号和胁迫反应机制。植物丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联在介导植物生物和非生物胁迫的反应中起重要作用,并且是细胞外刺激作为信号在细胞内被转导的主要途径。其中GhMKK6-GhMPK4级联信号通路在棉花免疫中起重要作用。分析GhMKK6-GhMPK4级联信号通路在棉花抗枯萎病中的作用和调控机制显得尤为重要。

为了分析被尖孢镰刀菌攻击的棉花的免疫反应,山东农业大学王琛课题组使用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术对GhMKK6下游的GhMPK4的功能进行分析,结果表明沉默GhMPK4会降低棉花对枯萎病的耐受性,并降低某些抗性基因的表达。GhMPK4与GhMKK6的过度表达都会导致不利的棉花免疫反应特性。综上,GhMPK4可能与SA通路介导的防御途径有关,因此可能在棉花防御真菌中起重要作用。

为了进一步研究植物在进化过程中的反馈调控机制。以GhMPK4作为诱饵蛋白质,利用Takara Matchmaker® Gold酵母双杂交系统( Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489)行酵母双杂交筛选,在棉花中筛选并鉴定了MAPK激酶蛋白磷酸酶AP2C1的负调节因子。通过对AP2C1的一系列功能分析发现,GhAP2C1与GhMPK4相互作用调节棉花对尖孢镰刀菌的免疫反应。以上结果,为功能分析和研究MAPK级联的反馈调节机制提供了重要数据,有助于阐明MAPK级联作用的调节机制以应对病原体。

非生物胁迫-水稻的磷酸盐饥饿反应

磷是植物生长和发育所必需的常量营养素,磷缺乏限制了全球30%耕地的作物产量。阐明植物中的磷信号通路将为提高作物磷利用效率和优化肥料施用提供信息。为了适应低磷环境,植物进化出复杂的调控机制,尽管近年来植物对缺磷反应的分子机制取得了很大进展,但植物响应和适应磷酸盐缺乏的分子机制尚不清楚。

为了探明该机制,浙江大学毛传澡课题组使用Takara Matchmaker®Gold酵母双杂交系统(Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489) 筛选与磷酸盐反应抑制因子OsSPX4(SPX4)具有相互作用的蛋白,获得了11个候选蛋白(25 个阳性菌落),包括OsbHLH6(8 个菌落)、OsPHR2 同源物和7种其他蛋白质。OsbHLH6(bHLH6)是一种编码碱性螺旋-环-螺旋蛋白的未表征的磷饥饿反应基因。其中bHLH6和SPX4之间的相互作用通过酵母双杂交技术(Y2H)测定得到证实。为了确定bHLH6的哪个结构域与SPX4相互作用,作者检测了SPX4与不同蛋白片段的bHLH6之间的相互作用。只有全长bHLH6与SPX4强烈相互作用。运用免疫共沉淀(Co-IP)及双分子荧光互补 (BiFC) 测定方法对SPX4与bHLH6在体内的相互作用进行检测,最终确定SPX4与bHLH6在体外和体内均有相互作用。

之后作者通过时空转录组、RT-qPCR、Pull down等研究分析得出结论,在磷缺乏的情况下,bHLH6的表达在芽中显著被诱导。bHLH6过表达系显示出磷积累和增强的磷饥饿反应,包括磷饥饿诱导(PSI)基因的上调和更长的根毛。bHLH6突变体在苗期没有表现出显著的表型变异。与OsPHR2相比,bHLH6与SPX4的结合亲和力更高,因此,bHLH6竞争性地抑制了SPX4和OsPHR2的相互作用。SPX4过表达挽救了在高磷和低磷条件下由 bHLH6过表达引起的磷积累。此外,在 SPX4背景中bHLH6的过表达不影响在高磷和低磷条件下SPX4的磷含量。bHLH6/SPX4双突变体在高磷条件下与SPX4突变体相比,表现出较低的茎磷浓度和OsPT3和OsPT10的转录本丰度。RNA测序结果表明bHLH6 OV和SPX4共享许多差异表达的磷反应基因。因此,bHLH6是拮抗SPX4的磷信号传导和稳态的重要调节因子。以上结果给阐明植物适应缺磷的分子调控提供了有力帮助,并将促进对低磷耐受性作物的培育。

【酵母杂交知识拓展】

酵母双杂交系统最初是由Fields等利用酿酒酵母GAL4转录因子的特性建立的,该研究成果被发表在《Nature》上。转录因子GAL4由两个可分离且功能必需的结构域组成:一个与特定DNA序列(UASG)结合的N端结构域;另一个是激活转录所必需的C末端结构域,基于此特性,Fields生成了一个包含GAL4的两种混合蛋白的系统:与蛋白质“X”融合的GAL4 DNA结合域和与蛋白质“Y”融合的GAL4激活区。如果X和Y可以形成蛋白质-蛋白质复合物并重建GAL4结构域的邻近性,则会发生由UASG调节的基因的转录。使用两种已知有相互作用的酵母蛋白——SNF1和SNF4对该系统进行测试,结果只有当两个融合蛋白都存在于细胞中时,才能获得高转录活性。由此得出,酵母杂交系统可通过使用半乳糖(报告基因)选择来识别与已知蛋白质相互作用的蛋白质。

目前,酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和GAL4系统两种。在LexA系统中,DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成,转录激活结构域由一个来自大肠杆菌的88个氨基酸残基组成的B42蛋白构成,它在酵母中可以活化基因的转录。

相较于LexA系统,GAL4系统的使用更加广泛,其中比较有代表性的当属Takara酵母杂交产品线--Matchmaker®系列产品(包括Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System、Make Your Own Mate & Plate Library System、Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2等众多产品),提供文库构建、大规模筛选和鉴别验证一站式解决方案,自问世以来,助力无数专家学者成功进行蛋白质互作研究,因其产品线完整、产品种类丰富、假阳性低,筛选高效,操作简单等特点,受到各个领域学者的欢迎!

Takara Matchmaker®系列产品广受欢迎,好评不断,三大亮点抢先看。

首先,提供多种组织特异的均一化Mate & Plate™通用文库,均一化处理降低了cDNA文库中高丰度转录本所占的比例,筛选的克隆数更少,并且可以确保筛选到包含中等丰富和低等丰度转录本的克隆。您可以花费较少的精力筛选到更多的独立克隆,并有更大的机会检测到重要的互作,更加省时省力。其中,均一化的拟南芥文库( Mate & Plate™ Library - Universal Arabidopsis (Normalized) 630487)尤其受到各位植物研究学者的欢迎,拟南芥作为模式植物,被广泛应用于植物生理学、分子生物学等多个研究领域。而该文库由从拟南芥11个组织中分离的mRNA构建而成,等量混合并转化到酵母菌株Y187中,提供完整的表达基因覆盖,可以直接用于双杂交筛选实验。

如果Mate & Plate™中没有适合您需要的文库,您可使用 酵母双杂交文库构建系统( Make Your Own Mate & Plate Library System 630490)自己制作文库,利用SMART cDNA合成技术,使用任意组织来源的低至100 ng的总RNA,即可构建cDNA文库。一周之内即可构建足够用于数百次酵母双杂交筛选实验所需要的文库。文库构建是在Y187文库酵母菌株中通过酵母高效的同源重组机制直接完成的,无需传统文库构建过程中的一些繁冗的操作 (比如文库克隆、扩增和大肠杆菌收集等),操作更简单,性价比更高。

除此之外,您还可以委托Takara进行cDNA文库及酵母单双杂交服务,服务种类多样,包括构建均一化、非均一化酵母单杂交、双杂交文库;单框、三框酵母文库;物种不限、部位不限,所有真核生物都可构建!

其次,酵母双杂交系统( Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System 630489),可以用于体内大规模的初步筛选蛋白质相互作用候选目标,采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统,由于任何prey蛋白单独结合引起假阳性都需要识别3个不同序列,激活4个报告基因的表达,有效地降低了假阳性。同时,报告基因中新型的、稳定的酵母双杂交抗生素AbA(630466),可以有效杀死非抗性克隆,从而大大降低了背景克隆的生长。

最后,对于蛋白质互作结果验证,除去使用酵母双杂交系统(630489)反向验证外,您还可以选择免疫共沉淀方法进行验证,IP和Co-IP是研究蛋白质与大分子(例如其他蛋白质)之间相互作用的很有意义的实验手段。Capturem™ IP & Co-IP Kit(635721)应用于IP和Co-IP实验,Takara特别的Capturem技术,实现了基于膜上的蛋白质捕获,从而使得免疫共沉淀纯化部分的操作时间从传统的数个小时缩减到5分钟左右,使实验效率显著提高。

不仅如此,Takara还提供适用于酵母双杂交系统、文库构建系统等的培养基及酵母质粒提取、酵母转化等各类辅助试剂,满足多种实验需求。

Takara用心做产品,不辜负您的每一次期待,提供酵母杂交一站式解决方案,让您的酵母杂交实验更简单方便!

参考文献:

Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245 246.
Guo, D., Hao, C., et al. (2022). The Protein Phosphatase GhAP2C1 Interacts Together with GhMPK4 to Synergistically Regulate the Immune Response to Fusarium oxysporum in Cotton. International journal of molecular sciences, 23(4), 2014.
He, Q., Lu, H., et al. (2021). OsbHLH6 interacts with OsSPX4 and regulates the phosphate starvation response in rice. The Plant journal: for cell and molecular biology, 105(3), 649 667.
Nishimura, M. T., & Dangl, J. L. (2010). Arabidopsis and the plant immune system. The Plant Journal, 61(6), 1053-1066.
Oh, C. S., & Martin, G. B. (2011). Effector-triggered immunity mediated by the Pto kinase. Trends in plant science, 16(3), 132 140.
Raghothama K. G. (1999). Phosphate Acquisition. Annual review of plant physiology and plant molecular biology, 50, 665 693. Zhu J. K. (2016).
Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants. Cell, 167(2), 313–324.

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