靶向p38γ激酶基因疗法治疗癫痫

【字体: 时间:2022年12月06日 来源:AAAS

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  高磷酸化微管相关蛋白tau与痴呆、癫痫和其他神经系统疾病有关。相比之下,p38γ激酶对苏氨酸205(T205)处tau的位点特异性磷酸化可使tau脱离毒性途径,在阿尔茨海默病中起到神经保护作用。

  

摘要

高磷酸化微管相关蛋白tau与痴呆、癫痫和其他神经系统疾病有关。相比之下,p38γ激酶对苏氨酸205(T205)处tau的位点特异性磷酸化可使tau脱离毒性途径,在阿尔茨海默病中起到神经保护作用。在不同的癫痫小鼠模型中使用病毒介导的基因传递方法,我们发现p38γ活性增强治疗降低了癫痫的易感性,恢复了神经元的放电模式,减少了行为缺陷,并改善了癫痫引起的死亡。此外,我们发现p38γ介导的tau在T205处的磷酸化对于癫痫的这种保护是必要的,因为缺乏这种关键的相互作用可以恢复病理特征并加速癫痫的发生。因此,我们的工作为将来应用p38γ治疗急性神经系统疾病提供了可能。

简介

癫痫目前影响全球7000万人,是最常见的神经系统疾病之一(1).癫痫可由遗传或后天病因引起;然而,神经网络的破坏通常是癫痫发生的基础。因此,过度的兴奋性神经元刺激和受损的抑制功能会引发过度兴奋和细胞毒性(=兴奋性毒性),这是包括痴呆、中风和癫痫在内的一系列神经疾病的共同特征。在抗药性癫痫的病例中,这种网络功能障碍导致临床表型的进展,包括抑郁症和其他精神疾病、认知障碍和癫痫相关死亡率(2,).鉴于痴呆症和中风患者的癫痫发病率更高,患有某些癫痫疾病的患者患痴呆症和中风的风险更大(4,5),针对一个共同的相关因素的干预疗法是非常有趣的。我们和其他人对阿尔茨海默病(AD)的研究表明tau蛋白参与兴奋性毒性信号传导(6).因此,神经元的过度兴奋参与了tau依赖的突触后兴奋毒性信号复合物,从而驱动下游的临床表型,并且这一过程通过突触后tau的高磷酸化增加而增强。此外,tau与中风、孤独症和癫痫综合征的兴奋性毒性有关(7,8)提示神经系统疾病有一种融合的、tau依赖的病理机制。虽然tau的高磷酸化是其病理状态的特征,但我们已经证明p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38γ对tau的磷酸化可从下游兴奋性毒性中给予神经保护(9,10).在这里,突触后p38γ通过其在tau残基苏氨酸205(tauT205)上的激酶活性介导保护作用,该激酶使tau脱离毒性信号复合物的形成,进而降低神经毒性并减轻认知功能的恶化(9,10).为了探讨突触后tau/p38γ相互作用在癫痫中的机制相关性,我们建立了两种癫痫小鼠模型:婴儿期癫痫性脑病-德拉韦综合征(DS)的遗传模型和化学诱导的癫痫小鼠模型,以研究急性和慢性发作效应。在这两种情况下,tau是已知的神经毒性介质;在DS和化学诱导的癫痫小鼠中,基因tau的缺失可以预防癫痫发作(1113).尽管如此,tau导致癫痫的确切机制仍不清楚。在这里,我们在诱导p38γ活动后的两种癫痫模型中都证明了显著的抗癫痫作用,并从机制上证明了这种激酶通过与tau的位点特异性相互作用来提供保护。

结果

p38γ激酶治疗对DS小鼠的保护作用

在最严重的儿童癫痫中,DS主要是由杂合子、功能丧失的致病性变体引起的SCN1A型基因,编码抑制中间神经元功能所需的钠通道亚单位。结果,神经元过度兴奋会引发难治性癫痫发作、行为障碍和癫痫患者的高猝死率(SUDEP)(14).为了研究这种脑病Scn1a型通过靶向基因第1外显子构建DS小鼠功能丧失模型Scn1a型在129个背景菌株中Scn1a型(129人;图1A以及图S1A)。与以前的报告一致(15),都是纯合的Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠Scn1a型功能丧失)从出生后第10天(P10)开始出现共济失调、体重减轻和癫痫发作,并在2周龄时出现癫痫诱发的致死性(图S1B)。杂合子Scn1a型+/Δ(129)小鼠预期寿命正常,无明显癫痫发作;然而,他们证明了神经元网络异常和行为与DS一致(图S1,B到E)。与以前的报告进一步一致(15)当杂交到易感癫痫的C57Bl/6(B6)背景上时,从3周龄开始,高比例的Scn1a型+/Δ(B6)小鼠在SUDEP前不久表现出异常行为和明显的癫痫发作(图S1,F至H)。因此,使用Scn1a型+/在129和B6背景下的Δ小鼠能够研究不同的DS方面。为了评估p38γ对DS表型的治疗作用,我们采用腺相关病毒(AAV)介导的基因传递方法来进行神经元特异性表达(见材料和方法)。出生时(P0),Scn1a型两种背景的小鼠静脉注射嗜神经性AAV(图1A)p38γ的组成活性(CA)形式的神经元表达(Scn1a型.p38γ加利福尼亚州)或非治疗控制(Scn1a。对照组),Western印迹和免疫组化证实其表达(图1B).为了评估p38γ对生存率的治疗作用,Scn1a型(B6)监测小鼠在7个月内癫痫诱发的死亡率;值得注意的是,过早死亡的发生率在Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(B6)小鼠,与Scn1a型+/Δ.对照组(B6)小鼠(图1C).在每个治疗组中,雄性和雌性小鼠的存活率没有差异。

图1p38γ激酶治疗对DS小鼠有保护作用。

(A)Scn1a型+/p38γ治疗研究中Δ小鼠系的产生及实验策略。(B)皮层(顶部)的Western印迹和海马体(底部)的免疫染色证实了p38γ的转基因表达加利福尼亚州[血凝素(HA)标记]或对照[绿色荧光蛋白(GFP)]6个月大的婴儿Scn1a型(B6)小鼠(来自n=每次治疗4至6只小鼠)。甘油醛-3磷酸酯(GAPDH)作为负荷控制。DAPI,4′,6-二氨基-2-苯基吲哚。(C)治疗后生存曲线Scn1a型(B6)小鼠;Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(B6)与非治疗对照组小鼠相比,小鼠的存活率显著提高[Scn1a型+/Δ.对照组(B6)]超过200天[n每组11只*P=0.0113***P=0.0006,以及****P0.0001(曼特尔-考克斯检验)]。(D)在5到6个月大的Scn1a(129)小鼠清醒期间,低(左)和高(右)频率的脑电图(EEG)功率谱密度分布。Scn1a型+/Δ.与对照组(129只)相比,对照组小鼠的功率谱密度显著升高Scn1a型+/+在θ(4到12赫兹)和伽马(25到100赫兹)频段的老鼠[*P=0.0156(θ)和****P0.0001(伽马射线)]。异常网络活动得到改善Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(129)表现出θ功率的小鼠与Scn1a型+/+两个治疗组的小鼠[**P=0.002(θ)和**P=0.0016(伽马);ns,无显著性差异(方差分析),尽管伽玛能与Scn1a型+/+.对照组小鼠(**P=0.0015)。伽马功率输入Scn1a型+/+.p38γ加利福尼亚州Scn1a型+/+.控制和Scn1a型+/+.p38γ加利福尼亚州老鼠(n=每组3至5只小鼠****P0.0001和**P=0.0041)。曲线下面积。(E)开放领域行为分析。Scn1a型+/+.对照组(129只)小鼠,Scn1a型+/Δ.对照组(129只)小鼠行走的距离明显更远,盘旋次数更多,进入内区的次数也更频繁[****P0.0001(距离)****P0.0001(循环),以及**P=0.0012(区域)]。行为Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(129)小鼠与Scn1a型+/Δ.对照组(129只)小鼠[**P=0.0086(距离)*P=0.0164(循环),和ns,P=0.2012(区域)],与Scn1a型+/+两个治疗组的小鼠[n=每组9至15只小鼠;ns(方差分析)]。

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海马脑电图(EEG)记录显示局部神经元群的活动,θ(4-12Hz)和伽马(25-100Hz)振荡模式(分别由兴奋性和抑制性神经元放电产生)表明了神经元网络同步性和认知功能的程度(16).海马脑电图记录Scn1a型+/Δ.129和B6背景的对照组小鼠在记录期间没有出现自发性癫痫样放电或癫痫发作(图S1C),与野生型窝鼠相比,它们的EEG在清醒期呈现出明显异常的θ和γ谱功率(图1D以及图S2A)。θ范围内的功率升高表示抑制作用不足,这与DS和DS小鼠模型患者的异常低频振荡一致(17),而伽马能的升高表明了对抗反常升高的θ功率的补偿反应。相比之下,治疗Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州在129和B6背景下的小鼠在θ和γ频率上都表现出标准化的光谱功率(图1D以及图S2A)。鉴于Scn1a型+/Δ.对照组(B6)小鼠(图1B以及图S2、B和C),以避免死亡率偏差,Scn1a型(129)用小鼠观察p38γ对DS行为表型的治疗作用。为了评估运动行为,Scn1a型(129)小鼠在开阔试验范式下进行试验(见材料和方法)。与DS患者的多动症和自闭症特征一致,Scn1a型+/Δ.与野生型相比,对照组(129只)的老鼠表现出多动性,它们的行走距离明显更远,绕圈行为更多,而且更喜欢进入竞技场中心Scn1a型+/+(129)两个治疗组的小鼠(图1E).相反,治疗组的异常行为减少Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州相比之下,老鼠出现了Scn1a型+/Δ.对照组(129只)小鼠。此外Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(129)与野生型小鼠相比,p38γ与对照组无显著差异加利福尼亚州AAV公司(图1E).在每个治疗组中,雄性和雌性小鼠的行为没有差异。

TauT205是癫痫的一个保护部位

我们假设p38γ在癫痫发作期间通过T205的tau磷酸化来发挥其保护作用,这与我们之前对AD的研究结果相似(9).因此,从Scn1a型(129)所有基因型小鼠在P14,此时,纯合子Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠在死亡前出现癫痫发作。Tau水平在Scn1a型+/+(129)(=野生型控制),Scn1a型+/Δ(129),以及Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠(图2A).然而,Scn1a型Δ/Δ(129)皮质的tau磷酸化在T205显著增加(ptauT205)(图2A).在没有改变ptauS202水平的情况下,ptauAT8(ptauS202/T205)信号显著增加进一步证实了这一点,这表明在癫痫发作期间,tauT205的靶向磷酸化。而p38γ的总水平在不同基因型之间是不可比的Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠的p38mapk活性磷酸化信号显著增加,提示在采集样本时激活了激活途径。在癫痫发作期间,MAPK的短期短暂激活已有报道(18).在其他探测位点[S202、S214、S396/S404(=PHF1)和S422]未检测到明显的τ磷酸化变化Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠死亡前。然而,我们发现在S262处tau有明显的磷酸化,这不是一个神经元p38γ靶点(9)但被微管亲和力调节激酶2(MARK2)磷酸化的两个位点中的一个(19).因此,tau磷酸化的普遍上调并不能解释不同部位磷酸化水平的升高,这表明这些部位的磷酸化发生在癫痫发作期间急性神经元过度兴奋的反应中,试图减轻兴奋性毒性诱导作为一种内源性保护机制Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠。此外,tau-pT205在Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州小鼠(图S2D),进一步认为tau中的T205是p38γ在DS中介导治疗益处的主要部位。

图2TauT205是癫痫的一个保护部位。

(A)2周龄大鼠脑的免疫印迹法Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠在T205(PTAUT05)、S202+T205(ptauAT8)和S262(ptauS262)处的tau磷酸化相对于标准化的总tau水平显著增加,并且与Scn1a型+/+(129)和Scn1a型+/Δ(129)只小鼠。同样,个人Scn1a型Δ/Δ(129)样本显示磷酸化p38mapk水平增加(pp38 MAPK)。在tauS202、tauS214、tauS422和tauPHF1(S396+S404)位点的总tau水平及其磷酸化以及p38γ总水平在这两个位点之间具有可比性Scn1a型+/+,Scn1a型+/Δ和Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠[n=每个基因型4至5只小鼠****P0.0001;ns(方差分析)]。(B)匹罗卡品介导的癫痫诱导前p38γ治疗研究的实验设计示意图。(C)匹罗卡品诱导6周龄儿童癫痫发作严重程度和潜伏期(上)、存活率(左下)和平均发作严重程度(右下)T205T/T和T205A/A小鼠,在4周龄时接受AAV治疗。野生型B6(p38γ预处理的T205T/T)小鼠加利福尼亚州(T205T/T.p38γ加利福尼亚州)潜伏期明显延长,出现更严重的癫痫发作(**P=0.0049),提高生存率(**P=0.0054),平均癫痫发作严重程度降低(**P=0.0015)与T205吨/吨。对照组小鼠。相反,T205A/A.p38γ加利福尼亚州与两者相比,小鼠在癫痫潜伏期、平均发作严重程度或存活率方面没有明显差异T205吨/吨。控制和T205A/A。对照组。因此,T205A/A.p38γ加利福尼亚州潜伏期明显缩短(***P=0.0007),平均癫痫发作严重程度增加(***P=0.0003),死亡率增加(***P=0.0006)与T205T/T.p38γ加利福尼亚州老鼠。n=每组15至20只小鼠(分别为方差分析和曼特尔-考克斯试验)。

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只有一小部分癫痫患者有已知的遗传原因(20).因此,为了进一步探讨p38γ在非遗传性癫痫发作中的保护机制,我们采用化学诱导癫痫模型来研究癫痫的急性和慢性两个方面。探讨p38γ对野生型B6小鼠急性发作的预防作用T205T/T)静脉注射嗜神经性AAV,观察p38γ的神经元表达加利福尼亚州(T205T/T.p38γ加利福尼亚州)或者一个控件(T205吨/吨。对照),给药前2周(图2B).匹罗卡品是一种毒蕈碱受体激动剂,可引起持续的神经元兴奋和兴奋性毒性机制的诱导,进而触发啮齿动物癫痫持续状态(SE)(21).毛果芸香碱治疗T205吨/吨。对照组小鼠出现严重癫痫发作,经常不能存活(图2C).相反,T205T/T.p38γ加利福尼亚州小鼠癫痫发作潜伏期明显延长,癫痫发作严重程度降低,癫痫诱发的死亡率显著降低(图2C).为了探讨p38γ促进癫痫发作改善的机制,转基因B6小鼠株,采用T205A/A;这种毒株有一只变异的老鼠地图与人T205相对应的残基处(编码tau蛋白的基因),编码磷酸化缺陷T205A/A型(图2B).当我们给药匹罗卡品时,p38γ的保护作用消失了T205A/A小鼠癫痫发作严重程度、潜伏期和死亡率与对照组无差异T205T/T小鼠,与p38γ预处理无关加利福尼亚州出现了癫痫发作和死亡率加快的趋势两个治疗组的T205A/A小鼠(图2C).

癫痫诱导后p38γ治疗具有保护作用

颞叶癫痫是最常见的局灶性癫痫;患者反复发作(持续发作,无侵袭性颞叶切除),伴有全脑细胞和结构层面的病理改变(22)认知功能下降和癫痫相关死亡率的高风险。因此,为了评估其在癫痫发作后的治疗潜力,仅在毛果芸香碱诱导后给予p38γ。在这里,我们使用了DBA/2小鼠,这些小鼠在注射匹罗卡品后出现癫痫发作,但没有高死亡率;DBA/2小鼠达到SE后,在匹罗卡品恢复后出现慢性自发性反复发作(SRS),从而重现了该病(23).给药毛果芸香碱后,给出现一次或多次强直阵挛发作的DBA/2小鼠静脉注射剂量的嗜神经AAV,观察p38γ的神经元表达加利福尼亚州(DBA/2.p38γ加利福尼亚州)或控制(DBA/2.control;图3A).每日观察显示,所有出现SE的小鼠都表现出与SRS一致的症状,包括注射后48小时的部分性和全身性癫痫发作,与AAV治疗无关。与以前的报告一致(23)对照组小鼠在慢性SRS期(治疗后48小时至5个月)死亡。相比之下,DBA/2.p38γ治疗组SRS诱导的死亡率显著降低加利福尼亚州(图3B).考虑到DBA/2小鼠慢性发作的发生率和对SRS诱发死亡率的高易感性,分别使用匹罗卡品给药后出现一次或多次癫痫发作但未出现SE的小鼠(即轻度癫痫模型)来评估长期神经网络的变化。治疗2个月后植入脑电图电极,并与未接受匹罗卡品或AAVs的未治疗组(DBA/2。未治疗)进行比较。脑电图显示匹罗卡品后癫痫样放电增加的趋势不显著,与p38γ无关加利福尼亚州或控制转基因传递(图S2E)。DBA/2.对照组小鼠高、低光谱功率显著增加(图3C)与未经治疗的DBA/2小鼠比较。相反,DBA/2.p38γ加利福尼亚州小鼠表现出正常的光谱功率。

图3.p38γ加利福尼亚州癫痫诱导后的治疗是保护性的。

(A)匹罗卡品介导的癫痫诱导后p38γ治疗研究的实验策略示意图。(B)毛果芸香碱诱导后的存活曲线显示DBA/2.p38γ有所改善加利福尼亚州与DBA/2对照组小鼠在注射毛果芸香碱后4个月的记录期(第0天)的存活率进行比较。n=每组9至11只小鼠*P=0.0150(曼特尔-考克斯试验)。(C)注射匹罗卡品2个月后DBA/2小鼠清醒时的脑电图功率谱密度分布。DBA/2。与未经处理的DBA/2小鼠相比,对照组小鼠的高光谱功率和低光谱功率显著增加(θ:***P=0.0002;伽马射线:****P0.0001)。DBA/2.p38γ加利福尼亚州与DBA/2相比,小鼠表现出明显的高光谱和低光谱功率。对照组小鼠(θ:***P=0.0010;伽马射线:****P0.0001)。DBA/2.p38γ加利福尼亚州θ范围(ns)与DBA/2组无显著差异。未经治疗的小鼠在γ范围内仍有适度增加(****P0.0001)。N=每组4只小鼠(方差分析)。

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讨论

p38γ激酶治疗对DS小鼠的保护作用

在这里,我们展示了p38γ对DS的几个临床相关方面的保护作用Scn1a型+/Δ(B6)小鼠。因此,我们认为增强p38γ激酶活性有助于减轻DS患者SUDEP发作的严重程度和/或频率Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州两种基因背景品系的小鼠,证明p38γ在减少海马过度兴奋引起的神经元网络畸变中起作用。异常行为减少Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(129)小鼠死亡率高Scn1a型+/Δ.对照组(B6)小鼠与存活的小鼠进行了决定性的行为测试Scn1a型+/Δ.p38γ加利福尼亚州(B6)不可能。p38γ加利福尼亚州在两种背景下的对照组中的表达导致了脑电图的紊乱,但没有明显的行为改变。因此,提高p38γ活性的治疗益处可能仅限于癫痫患者。综上所述,我们的研究结果提供了证据,即p38γ通过阻断触发DS中SUDEP的细胞机制发挥作用,通过阻止神经元回路的不平衡,这种网络保存可以改善细胞过程,导致DS的下游认知和行为症状。

癫痫发作后p38γ治疗具有保护作用

我们证明,在癫痫发作后,嗜神经p38γ激酶治疗对SRS诱导的小鼠死亡率具有显著的保护作用。考虑到相关治疗基因的表达仅发生在AAV给药后1-2周,我们的数据表明p38γ活性可能会降低慢性复发性癫痫患者的癫痫诱发死亡率,如TLE。此外,在癫痫发作后,我们揭示了持续性神经网络异常的存在,而p38γ活动使下游中毒事件中的癫痫样放电脱离,并在癫痫事件后恢复异常的神经网络功能。

tauT205是癫痫的一个保护部位

我们以前报道过tauT205是AD中p38γ介导的神经保护的主要部位(9,10).在这里,我们展示了T205的tau磷酸化在遗传和化学诱导的癫痫模型中的意义。ptauT205的显著上调Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠在明显癫痫发作期间提示tauT205磷酸化是神经元过度兴奋的早期事件。同样,p38γ加利福尼亚州在里面Scn1a型+/Δ(B6),但不是Scn1a型+/+(B6),小鼠经历了磷酸化增强的激活。总之,这意味着p38γ和ptauT205在癫痫发作过程中参与了内源性保护途径。然而,这并不足以挽救Scn1a功能的完全丧失,因为纯合性在小鼠和人类中都是致命的(15,24).从机制上讲,我们以前已经证明p38γ使T205的tau磷酸化,使支配AD兴奋性毒性的突触后信号复合物脱离(6,9).因此,我们推测p38γ活性的增加限制了癫痫的兴奋性毒性,因此通过tau的T205磷酸化和由此产生的突触后兴奋性毒性信号的抑制,限制了SE诱发的死亡。T205位点在癫痫中发挥p38γ介导的保护作用的重要性被p38γ几乎完全减弱的抗癫痫作用进一步强调加利福尼亚州无tauT205小鼠的预处理(=T205A/A)。然而,我们不能正式排除p38γ的其他未知分子靶点可能参与这些保护作用。p38γ能有效改善诱发SE和SE诱导死亡的急性癫痫机制,T205的tau磷酸化是这种保护的必要条件。在这个位点(=T205A/A)缺乏功能使p38γ不能tau磷酸化,从而减轻其治疗效果,并可能加速致痫过程。

tau高磷酸化的缺失Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠反对癫痫发作期间的滥交激酶活性,而是特异性激活激酶,如p38γ。Scn1a型Δ/Δ(129)小鼠在S262处出现明显的tau磷酸化,这不是p38γ靶点(9).S262磷酸化由MARK2介导(19).tau在S262处的磷酸化破坏了它与微管的相互作用(19,25),提出了一个有趣的观点,即在癫痫发作过程中,微管动力学会发生变化。然而,MARK2在癫痫中的作用仍有待进一步研究。

总之,我们发现,在癫痫发作前,p38γ的过度激活显著减弱了两种癫痫小鼠模型的异常神经元功能、行为紊乱和癫痫诱发的死亡率。p38γ似乎使tau从突触后的癫痫相关通路中脱离,从而减轻下游的临床结果。这是通过tauT205的磷酸化介导的。此外,我们证明,癫痫发作后给予p38γ可显著恢复匹罗卡品癫痫模型中的神经网络模式,并减少分子过程,导致癫痫诱发的死亡率。因此,我们建议提高p38γ的活性作为预防和治疗以网络功能障碍和兴奋性毒性为特征的疾病的多用途治疗靶点。

材料和方法

老鼠

从澳大利亚生物资源中获得129S6/SvEvTacAusb(129)小鼠。C57Bl/6J(B6)和DBA/2J(DBA/2)小鼠来自澳大利亚动物资源中心。所有的动物都被安置在麦格理大学的中心动物设施(CAF)中并接受测试。小鼠在单独通风的笼子中,在12小时光照/12小时黑暗周期中自由获取食物和水。所有涉及动物的实验均经麦格理大学动物伦理委员会批准,并根据澳大利亚法律(AEC 2017/053、2017/033和2018/019)进行。所有的测试和分析都是由不了解基因型和治疗方法的研究人员完成的。随机选择小鼠。CAF内的小鼠定期进行病原体筛查,并清除以供实验使用。在研究期间,实验鼠每周称重两次,患有非相关健康问题(如错牙合和脑积水)的小鼠被排除在研究之外。实验中使用的动物数量见表S1。

DS鼠标模型

小鼠的第一个外显子Scn1a型基因(Ensembl,ENSMUSG00000064329)通过CRISPR介导的基因打靶(指南1:5′-tttaatgttccacgttctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcgctcca-3′,通过CRISPR介导的基因靶向,去除内源性起始密码子(图S1A)。这些单导RNAs是利用计算工具合理设计的,以尽量减少偏离目标(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/breakingcas/)如前所述,T7结合前向引物通过聚合酶链反应生成线性模板(26).引导物与S.p.Cas9蛋白(新英格兰生物实验室,M0646T)孵育,形成核糖核蛋白(RNP)复合物。将RNPs电穿孔(NEPA21,Nepagene)成129个受精卵,其浓度分别为:320 ng/μl的Cas9和80 ng/μl的每一个导管。选择的创始人在内源性Scn1a型轨迹。编辑后的等位基因(图S1A)的Sanger测序(Macrogen,韩国)显示了138个碱基对的缺失,删除了关键的起始密码子。培育这个创立者是为了建立殖民地,然后将老鼠维持在129个背景下[称为Scn1a型+/Δ(129)]或与B6小鼠杂交一次产生F1混合应变[称为Scn1a型+/Δ(B6)]。

tauT205A小鼠模型

小鼠T194密码子的单碱基对点突变地图(与人类相似的部位T205)是先前用CRISPR-Cas9基因编辑技术在B6合子中产生的(10),将编码氨基酸从苏氨酸改为丙氨酸,使tau磷酸化在194处缺失。正确靶向的小鼠被培育成纯合性(T205A/A),并保持纯合子用于本研究。

AAV治疗

AAV构造如前所述被生成和打包(10).简言之,转基因CA p38γ,p38γ加利福尼亚州(第38页γAsp179Ala)和一个编码绿色荧光蛋白(GFP)的非治疗对照品,在神经元特异性启动子h-突触蛋白(h-synapsin)的控制下,分别包装成复制缺陷型嗜神经性AAV(AAV-PHP)。B(27):AAV-PHP.B-syn1-p38γ加利福尼亚州和AAV-PHP.B-syn1-表皮生长因子.在DS小鼠中治疗,40μl AAV颗粒(5×1013病毒颗粒/ml)经颞静脉注入冷冻麻醉的P0Scn1a型老鼠(28).用尾静脉注射100μl AAV颗粒治疗匹罗卡品致痫小鼠。野生型B6和T205A/A(B6)小鼠在4周龄(5×10)时进行治疗12病毒颗粒/ml),癫痫诱导前10天。DBA/2小鼠在10周龄(5×10)时进行治疗13病毒颗粒/ml),给药后3小时。治疗Scn1a型通过AAV给药,每个AAV治疗组至少三窝小鼠。治疗T205吨/吨,T205A/A和DBA/2小鼠分为两组(每个队列中的相同数量的小鼠被分配到每个AAV治疗组)。

癫痫发作

如前所述,进行匹罗卡品介导的癫痫诱导(29).简要地,n-甲基东莨菪碱(1mg/kg)经腹腔注射,以防止外周反应,在6周龄雄性B6(简称为T205T/T)或T205A/A小鼠和毛果芸香碱(300mg/kg,ip)注入雄性DBA/2小鼠。癫痫发作用改良的Racine量表评分:0,无发作;1、静止不动;2、尾部延伸;3、轻度震颤(“湿狗抖”);4,部分阵挛;强直阵挛发作(<1min);6、强直阵挛发作伴意识丧失(>5min);强直阵挛性发作伴意识丧失(持续时间>20min)或发作性死亡。呼吸困难或呼吸停止的小鼠立即按照伦理规范实施安乐死。3小时后,给存活小鼠注射安定(10mg/kg)以减轻惊厥发作。DBA/2小鼠表现出一次或多次5级惊厥(但未达到SE)在给予匹罗卡品2个月后进行脑电图记录。在给药匹罗卡品后的5个月内,监测发生SE的DBA/2小鼠SRS诱导的死亡率。匹罗卡品给药后48小时内死亡的小鼠被排除在存活研究之外。每个治疗组的小鼠和菌株/基因型至少来自两个单独的实验。

脑电图记录

如前所述,将脑电图电极植入6个月龄的混合性别DS小鼠和18周龄匹罗卡品治疗的雄性DBA/2小鼠的海马(16).简单地说,在麻醉下,小鼠被安置在立体定向框架上,并通过手术将电极植入右侧海马体。术后至少5天后,将单独饲养的小鼠置于其家中笼中的脑电图接收器平台(DSI),并使用Ponemah软件(DSI)记录48小时自由活动期间的脑电图数据。使用NeuroCore软件(DSI)对记录进行分析。

行为测试

采用前面所述的开放场试验范式评估小鼠的新颖性诱导活性(9,30).简单地说,露天场地由40厘米×40厘米、光线昏暗、隔音的外壳组成。将性别混合的动物单独放置在野外中心,用航空摄像机和Empia捕捉软件记录10分钟。使用任何迷宫视频跟踪软件(St?ltering)完成行为分析。在3至4周龄或2个月龄和5至6个月龄时对各组小鼠进行测试。

免疫印迹法

经心灌注1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)后,在冷放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(20 mM Mops(pH 7)、1%Triton X-100、0.25%、脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、150 mM NaCl、2 mM EGTA(pH 8)、5 mM EDTA(pH 8)缓冲液中提取并匀浆,30 mM NaF,60 mMβ-甘油磷酸,20 mM焦磷酸钠,1 mM原钒酸钠,5μM胃蛋白酶抑制剂A,1μM二硫苏糖醇,和蛋白酶抑制剂(每10 ml一片)]。然后对样品进行短暂超声处理,并在4°C下以14000 rpm离心30分钟,以产生RIPA可溶部分。蛋白质浓度由比辛酸测定法(BCA法)(皮尔斯,赛默飞世尔科学公司)测定。如前所述,进行免疫印迹(9,10).使用的抗体如下:抗Nav1.1(Neuromab,K74/71)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(anti-GAPDH;Millipore,MAB374)、抗血凝素(HA;细胞信号技术,克隆C29F4:3724S)、抗GFP(Abcam,ab290)、抗Tau5(Invitrogen,AHB0042)、抗磷酸化T205-tau(Abcam,ab181206),抗磷酸化S214τ(Abcam,ab170892),抗磷酸化S422 tau(Abcam,ab79415),抗磷酸化S202 tau(Abcam,ab108387),抗磷酸化S262 tau(Invitrogen,44-750G),抗磷酸化tau AT8(ser1202/推力205)(Invitrogen,MN1020),抗磷酸化τPHF1(Ser396/Ser公司404)(痴呆症研究中心内部生产)、抗p38γ(研发系统,AF1347)、抗磷酸化p38(细胞信号技术,4631)和与辣根过氧化物酶偶联的次级抗体。每种抗体的Western blotting一式两份,每个基因型和治疗组至少有三个生物复制。利用化学发光系统(Bio-Rad)对膜进行化学发光成像。免疫印迹的密度分析用imagelab6.0软件进行。

免疫组织化学

在1×PBS经心灌注后,将左脑半球固定在4%多聚甲醛中过夜(4℃),并使用Excelsior组织处理器(Thermo Fisher Scientific)进行处理。然后将样本包埋在石蜡中,并以3μm的厚度切片(Thermo Fisher Scientific,HM325)。如前所述进行免疫染色(10).简单地说,抗原回收后,组织切片被阻断并渗透(5%驴血清+0.1%Triton X-100)。一级抗体,抗GFP(Abcam,ab290)和抗HA(细胞信号技术,克隆C29F4:3724S),观察AAV转基因表达,在载玻片上培养过夜(4°C)。在4′,6-二氨基-2-苯基吲哚染色前,将Alexa-Fluorphore偶联二级抗体488和568(分子探针)稀释在阻断缓冲液(5%驴血清)中,在玻片上培养1小时,然后用AxioScan显微镜载玻片扫描仪(蔡司)将载玻片进行共焦成像。

统计分析

用于分析单变量,未配对t进行了测试。对于多个数据组,采用单向方差分析(ANOVA)和Tukey的多重比较检验。生存分析采用log-rank(Mantel-Cox)检验。唤醒期间海马脑电记录的功率谱密度通过曲线下面积分析确定,然后是不成对的t测试或单因素方差分析。通过从24小时记录周期中检测到的峰值数量来进行峰值评分,并以每小时的峰值数量进行计算。所有数据均以±SEM表示。

图表

实验工作流的图表是使用BioRender.com网站.

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