自动化显微成像技术进行ddPCR 筛查癌症相关点突变

【字体: 时间:2022年12月22日 来源:安捷伦BioTek

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  本次给大家介绍的是一种使用离心微流控 4 重 ddPCR 技术进行结直肠癌 KRAS 位点突变的技术方法。

数字 PCR 原理及其优势

作为一种核酸绝对定量技术,数字 PCR(dPCR)无需标准曲线,且具有灵敏度高、线性好等特点。类似于单细胞克隆的细胞株分离构建,dPCR 采用有限稀释法将核酸溶液分散至反应单元(微滴、芯片微反应器或微孔板孔)中,使得每个反应单元的核酸模板数量 ≤1 个,经过 PCR 反应循环,即可通过荧光信号确定核酸模板数量。

dPCR 通常分为微滴式 digital drop RCR(ddPCR)和芯片式 chip digital PCR(cdPCR)两种,由于 cdPCR 构造比较复杂,成本较高,而 ddPCR 则具有操作简单、高通量的特点,因此 ddPCR 越来越受到欢迎,尤其广泛聚焦在大量 WT DNA 背景中筛查少量突变位点的癌症诊断方向。

本次给大家介绍的是一种使用离心微流控 4 重 ddPCR 技术进行结直肠癌 KRAS 位点突变的技术方法。

Mediator Probe PCR 实验原理


图 1 媒介探针(Mediator Probe)和通用探针(Universal Reporter)结构

实验设计巧妙地使用了媒介探针(Mediator Probe, MP)和通用探针(Universal Reporter, UR)两种寡聚核苷酸。

媒介探针 5’ 端区域为与 UR 特异性结合的基因序列即 mediator ,3’ 端为靶点特异性结合区域也就是 probe ,可特异性结合基因位点。

通用探针 5’ 端为茎环状发卡二级结构,5’ 末端链接有淬灭基团,相反的另一端连接有荧光基团,荧光基团和淬灭基团二者空间上紧密靠近,并通过连接二者的亚胺进行充分的荧光共振能量转移(FRET),从而将荧光基团激发后的荧光进行淬灭。


图 2 使用媒介探针 MP 进行 PCR 反应原理图

在 PCR 进程中,DNA 变性形成单链后,媒介探针 MP 随即和 DNA 特异性序列结合(图 2C)并在聚合酶和引物的作用下进行延长;当聚合酶跨过 MP 的位置时,其具有的核酸外切酶活性将 MP 的 5’ 端 Mediator 切掉并释放到溶液中(图 2D),随着 DNA 的复制,Mediator 逐渐积累;Mediator 在溶液中扩散并被通用探针 UR 的杂交位点捕获结合(图 2E),并在聚合酶的作用下将 Mediator 的 3’ 端延长,当到达发卡结构位置时(图 2F),通过可能的两种方式将淬灭基团和荧光基团进行分离,一种是将淬灭基团直接切割(图 2G),另一种是使发卡结构松动并打开(图 2H),两种方式最终使荧光基团淬灭的 FRET 解除,即可在相应检测仪器中检测到荧光,从而通过荧光间接定量核酸浓度。

Mediator Probe PCR 实验独特优势在于可拓展为多重荧光标记靶点,且靶点配色方案不固定,因此可根据不同的应用轻松进行调整。使用此方法,作者分别设计了 4 组 MP 和 4 种荧光基团标记的 UR 探针,用于 ddPCR 过程中对 3 种不同的基因突变位点和 WT 基因位点进行筛查测定。

ddPCR 实验设计及条件优化

由于 ddPCR 的微滴体积小,容易蒸发,PCR 过程和结束后液滴又容易融合,因此为了确保微滴生产过程中和 PCR 热循环过程中微滴的稳定性,避免蒸发和融合,PCR Mix 乳化 oil 、PCR-oil 以及其中的表面活性剂必须认真选择和进行浓度优化。

LabDisk 的 12 位 ddPCR 平台具有通量高的特点,搭配 Lionheart 全自动显微成像系统和 Gen5 高内涵分析软件,通过自动图像捕获和自定义分析管线设定,非常适合进行引物和探针浓度摸索,和不同实验靶点检测灵敏度验证等实验。


图 3 Lionheart LX 和 Gen5 软件搭配用于 LabDisk 全自动 4-plex ddPCR 微滴的全自动荧光拍摄和分析工作流程

实验中,将 mutant DNA 稀释为 4 个浓度:3540 、354 、35 和 3.5 个 copies(cps)每个反应,用于每个 mutant 靶点,而 wild type DNA 浓度被固定在大约 15000 cps /反应。PCR 反应接受后,将 12 个 ddPCR 单元进行裁剪并粘贴在玻片上,使用 2.5x 物镜进行 56 个视野 Montage 扫描,Gen5 软件进行拼接,具体扫描参数如下:GFP 、RFP 、Texas Red 和 CY5 通道分别用于拍摄 FAM 标记的 WT 靶点、HEX 标记的 KRAS G12V 点突变、AttoRho 101 标记的 KRAS G12A 点突变和 Cy5 荧光基团标记的 KRAS G12D 序列。


表 1 Lionheart 自动拍摄参数设定

Gen5 软件通常可以用于细胞和细胞器计数分析,在这里,经过略微的调整,用于微滴计数并进行阳性和阴性微滴辨别。具体参数有背景荧光测定、微滴直径范围(45um ~ 90um)、微滴形状(圆度 >0.6)和荧光强度阈值。在进行亚群分析区分阳性和阴性微滴时,圆度和平均荧光强度这 2 个参数必不可少,非常重要的一点是,圆度作为分析参数,可有效排除灰尘颗粒或其他杂质。由于 GFP 通道具有最高的微滴背景信号,因此可用于检测计算微滴总数量,其余每个通道都作为一个亚群分析不同的突变位点。


图 4 Gen5 全自动微滴分析管线示例图

实验数据分析及结果发表


图 5 离心微流控 ddPCR 图像及明场拍摄的微滴

正如上文所述,12 个单元不但允许在一次诊断应用中进行大量的反应,而且能够高效地优化微滴稳定性参数。在 2% 表面活性剂浓度下,可产生均一的微滴,但在PCR循环阶段,oil 会完全蒸发,导致大量的微滴融合。图 6A 展示了由于没有表面活性剂导致的微滴融合,融合微滴显示出更亮的亮度。


图 6 评估乳化 oil 和 PCR-oil 中的表面活性剂浓度

由于 oil 的蒸发也依赖于 PCR 循环的参数,包括温度和循环次数,因此不同的实验条件,表活剂的浓度可以进行优化调整,本实验中,4% 和 6%的表面活性剂浓度能够很好地保证微滴产生和 PCR 过程中的稳定性,而较低 2% 或过高则都会产生微滴融合。

荧光图片相对于明场,具有更高的对比度,在微滴测定阶段,使用 Gen5 软件全自动测量 6000 个微滴,测得其平均直径为 82.7±9 um ,由此可计算得知 10ul PCR mix 大约可产生 35000 个微滴。通过计算和曲线拟合,可发现每个突变靶点都具有非常高的线性(R2=0.99),并且均达到了 35 cps /反应 的检测限(LoQ),甚至可检测到更低浓度的 KRAS G12V 和 KRAS G12A 突变到 3.5 cps /反应。


图 7 微滴多色荧光叠加拍摄和核酸浓度分析

表 2 不同靶点 DNA 浓度计算统计

通过使用 4 重 ddPCR 结合 Lionheart 全自动显微成像平台,优异的实验数据也向我们证明了这一技术的高灵敏度,同时也展示了在癌症筛查中的应用潜力。感兴趣的小伙伴快来利用你身边 Agilent BioTek 的 Lionheart 系列和 Cytation 系列全自动成像系统试一试吧!

参考文献

1、Mediator probe PCR: a novel approach for detection of real-time PCR based on label-free primary probes and standardized secondary universal fluorogenic reporters. Clin Chem. 2012 Nov;58(11):1546-56.

2、Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides. Anal. Methods 2018, 10, 3444–3454.

3、Centrifugal Microfluidic Integration of 4-Plex ddPCR Demonstrated by the Quantification of Cancer-Associated Point Mutations. Processes 2021, 9, 97.

关于 BioTek

BioTek 是世界领先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司,拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果,配合友好强大的操作软件,为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学,促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司,成为细胞分析事业部的重要组成成员。

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