从qPCR到空间转录组学,基因表达分析平台如何选?

【字体: 时间:2022年12月30日 来源:生物通

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  目前,分析转录组的平台有很多,从早期流行的qPCR和微阵列芯片平台,到当下大热的RNA测序平台,以及代表未来的空间转录组学,每个平台都有自己的优缺点。在此,我们将回顾各个平台的特点,以及如何选择。

在如今的生物医学分析中,了解哪些基因在细胞或细胞群中表达是必不可少的。例如,比较不同时间、不同物种以及健康组织与患病组织之间的RNA水平差异,有助于我们了解表型差异的分子基础。这些信息可以帮助临床医生确定疾病的病因,或帮助研究人员确定下一步研究的通路和靶点。

目前,分析转录组的平台有很多,从早期流行的qPCR和微阵列芯片平台,到当下大热的RNA测序平台,以及代表未来的空间转录组学,每个平台都有自己的优缺点。在此,我们将回顾各个平台的特点,以及如何选择。

全转录组分析还是靶向分析?

基因表达平台可根据几种不同方式进行分类。例如,你的分析对象是整个转录组,还是一组特定的基因?

RNA测序(RNA-seq)和微阵列芯片虽然是完全不同的技术,但两者都能同时分析大量基因的转录本。RNA-seq可分析的基因数量没有上限,而芯片能够对数万个基因进行分析。佛罗里达大学ICBR基因表达和基因分型核心实验室的Yanping Zhang主任解释说,人们通常用这些技术来捕获基因表达差异,比如在整体上比较癌细胞系与正常细胞系有何不同。

相比之下,定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)通常只用于少数几个基因。Bio-Rad的高级应用经理Angelica Olcott指出,在评估大量样本的少数几个基因时,dPCR和qPCR是不错的选择。例如,在验证大规模基因表达筛查的结果时,你可以选择dPCR或qPCR。

RNA测序

RNA测序是将RNA逆转录成cDNA,然后对cDNA开展新一代测序(NGS)分析。它拥有几乎无限的动态范围,因为它会根据reads计数产生绝对的(而不是相对的)表达值。NGS不需要事先了解基因组,但在分析过程中通常需要将序列映射回参考序列。不过,NGS分析的成本很高,而且生成了大量数据,需要一位专业的生物信息学家来解释。

“在癌症研究中,RNA-seq已变得非常流行,因为它能够在单次实验中全面分析转录组变化,或描绘全基因组范围的基因表达水平,” Olcott指出。

“目前,人们多采用RNA-seq来整体分析组织样本中所有细胞的各种基因表达,或在单细胞水平上评估不同细胞类型的表达水平异质性,”她补充说。

微阵列芯片

基因表达芯片的表面包含一组寡核苷酸探针,互补的cDNA片段与之杂交后,触发探针发出荧光。之后通过扫描信号强度并分析数据,可以揭示每个RNA靶点的相对丰度,这通常以热图的形式显示。“在分析多个基因时,芯片分析是非常划算的,” Olcott指出。

然而,对于大多数研究而言,RNA-seq已经在很大程度上取代了芯片。例如,Zhang主任所在的核心实验室仍使用芯片来进行基因分型,但“我们刚刚淘汰了基因表达芯片”。

当然,在一些研究领域,芯片仍然是检测大量RNA表达的首选方法。Arraystar的高级科学家Yanggu Shi解释说,长链非编码RNA(lncRNA)的表达,包括环状RNA(circRNA)及其他许多非编码RNA种类,可能在RNA-seq分析中被掩盖,要么被严重低估,要么根本没发现,因为它们的丰度远低于mRNA。

qPCR & dPCR

RNA-seq和芯片能够一次检测(几乎)整个转录组,但通常只检测一个或极少数样本。qPCR和dPCR则不同,它们只检测相对较少的基因产物,但可以检测大量样本。两者都能对单个反应孔中的多个靶点进行多重检测。这两种PCR技术带来了灵敏而特异的检测和定量。

qPCR“带来了更高的样本通量,仪器上可以运行384孔板,从而推动了自动化应用”,Olcott指出。“这种方法经济实惠,速度快,许多研究人员都熟悉,也很容易掌握……现已成为许多实验室的常规方法。”它具有较宽的动态范围,能够在相同条件下处理稀释样本和浓缩样本,并且能够区分不同的剪接变体。

dPCR能够对靶点进行绝对定量,而不需要标准曲线。这样能够更好地检测和区分稀有的等位基因,也可以区分比较小的表达变化(比如,不到两倍)。与qPCR相比,它对复杂样本中的PCR抑制剂有更好的耐受性,对二级结构也不大敏感,需要的样本量较少。不过,这种方法的成本较高,需要更长的时间才能获得结果。

空间转录组学

当然,还有很多平台在争夺基因表达的客户,而每个平台都有自己独特的优势。例如,有些平台依赖微珠捕获过程,而有些则采用非酶促扩增来避免PCR偏倚。一些能够检测极大量的基因,而另一些则带来了更高的通量,可实现靶向表达分析。一些平台检测大量细胞的RNA,而另一些则更关注单细胞。

其中,最令人兴奋的创新来自空间生物学。有了空间转录组学,人们能够在二维甚至三维的背景下观察RNA在细胞或组织中的表达。“这是一个非常热门的话题,每个人都在谈论它,”Zhang主任说。“不过,使用它的人还不是很多,至少在我们机构是这样。”

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