从qPCR到空间转录组学，基因表达分析平台如何选？

在如今的生物医学分析中，了解哪些基因在细胞或细胞群中表达是必不可少的。例如，比较不同时间、不同物种以及健康组织与患病组织之间的RNA水平差异，有助于我们了解表型差异的分子基础。这些信息可以帮助临床医生确定疾病的病因，或帮助研究人员确定下一步研究的通路和靶点。

目前，分析转录组的平台有很多，从早期流行的qPCR和微阵列芯片平台，到当下大热的RNA测序平台，以及代表未来的空间转录组学，每个平台都有自己的优缺点。在此，我们将回顾各个平台的特点，以及如何选择。

全转录组分析还是靶向分析？

基因表达平台可根据几种不同方式进行分类。例如，你的分析对象是整个转录组，还是一组特定的基因？

RNA测序（RNA-seq）和微阵列芯片虽然是完全不同的技术，但两者都能同时分析大量基因的转录本。RNA-seq可分析的基因数量没有上限，而芯片能够对数万个基因进行分析。佛罗里达大学ICBR基因表达和基因分型核心实验室的Yanping Zhang主任解释说，人们通常用这些技术来捕获基因表达差异，比如在整体上比较癌细胞系与正常细胞系有何不同。

相比之下，定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）通常只用于少数几个基因。Bio-Rad的高级应用经理Angelica Olcott指出，在评估大量样本的少数几个基因时，dPCR和qPCR是不错的选择。例如，在验证大规模基因表达筛查的结果时，你可以选择dPCR或qPCR。

RNA测序

RNA测序是将RNA逆转录成cDNA，然后对cDNA开展新一代测序（NGS）分析。它拥有几乎无限的动态范围，因为它会根据reads计数产生绝对的（而不是相对的）表达值。NGS不需要事先了解基因组，但在分析过程中通常需要将序列映射回参考序列。不过，NGS分析的成本很高，而且生成了大量数据，需要一位专业的生物信息学家来解释。

“在癌症研究中，RNA-seq已变得非常流行，因为它能够在单次实验中全面分析转录组变化，或描绘全基因组范围的基因表达水平，” Olcott指出。

“目前，人们多采用RNA-seq来整体分析组织样本中所有细胞的各种基因表达，或在单细胞水平上评估不同细胞类型的表达水平异质性，”她补充说。

微阵列芯片

基因表达芯片的表面包含一组寡核苷酸探针，互补的cDNA片段与之杂交后，触发探针发出荧光。之后通过扫描信号强度并分析数据，可以揭示每个RNA靶点的相对丰度，这通常以热图的形式显示。“在分析多个基因时，芯片分析是非常划算的，” Olcott指出。

然而，对于大多数研究而言，RNA-seq已经在很大程度上取代了芯片。例如，Zhang主任所在的核心实验室仍使用芯片来进行基因分型，但“我们刚刚淘汰了基因表达芯片”。

当然，在一些研究领域，芯片仍然是检测大量RNA表达的首选方法。Arraystar的高级科学家Yanggu Shi解释说，长链非编码RNA（lncRNA）的表达，包括环状RNA（circRNA）及其他许多非编码RNA种类，可能在RNA-seq分析中被掩盖，要么被严重低估，要么根本没发现，因为它们的丰度远低于mRNA。

qPCR & dPCR

RNA-seq和芯片能够一次检测（几乎）整个转录组，但通常只检测一个或极少数样本。qPCR和dPCR则不同，它们只检测相对较少的基因产物，但可以检测大量样本。两者都能对单个反应孔中的多个靶点进行多重检测。这两种PCR技术带来了灵敏而特异的检测和定量。

qPCR“带来了更高的样本通量，仪器上可以运行384孔板，从而推动了自动化应用”，Olcott指出。“这种方法经济实惠，速度快，许多研究人员都熟悉，也很容易掌握……现已成为许多实验室的常规方法。”它具有较宽的动态范围，能够在相同条件下处理稀释样本和浓缩样本，并且能够区分不同的剪接变体。

dPCR能够对靶点进行绝对定量，而不需要标准曲线。这样能够更好地检测和区分稀有的等位基因，也可以区分比较小的表达变化（比如，不到两倍）。与qPCR相比，它对复杂样本中的PCR抑制剂有更好的耐受性，对二级结构也不大敏感，需要的样本量较少。不过，这种方法的成本较高，需要更长的时间才能获得结果。

空间转录组学

当然，还有很多平台在争夺基因表达的客户，而每个平台都有自己独特的优势。例如，有些平台依赖微珠捕获过程，而有些则采用非酶促扩增来避免PCR偏倚。一些能够检测极大量的基因，而另一些则带来了更高的通量，可实现靶向表达分析。一些平台检测大量细胞的RNA，而另一些则更关注单细胞。

其中，最令人兴奋的创新来自空间生物学。有了空间转录组学，人们能够在二维甚至三维的背景下观察RNA在细胞或组织中的表达。“这是一个非常热门的话题，每个人都在谈论它，”Zhang主任说。“不过，使用它的人还不是很多，至少在我们机构是这样。”